正交設計法優(yōu)選蓯歸益腎膠囊提取工藝

段賢春，陳 曦，2，汪永忠*，高家榮，朱 紅，韓燕全，李 穎，方朝暉，夏倫祝

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽合肥 230031)

蓯歸益腎膠囊是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院多年臨床使用的經(jīng)驗方，由肉蓯蓉、當歸、山茱萸等組成，具有溫陽固腎、養(yǎng)陰益氣、活血利水之功效，主要用于陰陽兩虛型糖尿病腎病。動物實驗［1-2］發(fā)現(xiàn)，其對2型糖尿病大鼠腎小球、腎小管具有顯著的保護作用，抑制腎小球增大，減少病變腎小球數(shù);并能改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，保護胰島細胞。前期臨床研究顯示［3-4］，蓯歸益腎膠囊可以降低糖尿病腎病患者血漿內(nèi)皮素和改善血小板功能，繼而改善臨床癥狀，對早期糖尿病腎病有較好的治療用。本實驗采用L9(34)正交設計，以君藥肉蓯蓉中所含的松果菊苷、毛蕊花糖苷2種成分總含有量、臣藥山茱萸中馬錢苷含有量以及浸膏得率為指標，以乙醇體積分數(shù)、乙醇倍數(shù)、提取次數(shù)、提取時間為考察因素，優(yōu)選提取工藝，以便更好地應用于臨床。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters UPLC超高效液相色譜儀 (美國Waters公司);KDM型恒溫電熱套 (山東省鄄城光明儀器有限公司);HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限工司);KQ3200DB型超聲儀 (昆山市超聲儀器有限公司);BP211D十萬分之一電子分析天平 (德國賽多利斯)。

1.2 試藥 松果菊苷對照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號111670-200503);毛蕊花糖苷對照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號11530-201208);馬錢苷對照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號111640-201005)，乙腈、甲醇 (色譜純，美國Tedia公司);屈臣氏蒸餾水;其余試劑均為分析純。藥材由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)鑒定為《中國藥典》2010年版一部所收載品種。

2 方法與結果

2.1 正交工藝設計［5］采用L9(34)正交方案。根據(jù)單因素試驗的結果，選取影響醇提效果的主要因素:乙醇體積分數(shù) (A)、乙醇用量 (B)、提取時間 (C)、提取次數(shù) (D)作為考察因素，試驗因素水平見表1。按處方比例稱取藥材，按正交實驗表安排實驗。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.2 UPLC雙通道法測定干膏中松果菊苷、毛蕊花糖苷、馬錢苷的量

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm);乙腈為流動相A，0.1%磷酸為流動相B;體積流量0.25 mL/min;柱溫30℃;檢測波長330 nm(檢測松果菊苷、毛蕊花糖苷)，240 nm(檢測馬錢苷);進樣量1 μL，梯度洗脫程序見表2。在此色譜條件下，松果菊苷、毛蕊花糖苷、馬錢苷與其他成分可達基線分離。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution manner

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取松果菊苷對照品2.05 mg、毛蕊花糖苷對照品2.10 mg，分別用50%甲醇定容至10 mL，搖勻，配制成對照品貯備液［6］。精密移取松果菊苷對照品貯備液2.5 mL，毛蕊花糖苷對照品貯備液1.25 mL置5 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻制成含松果菊苷 0.1025 mg/mL、含毛蕊花糖苷 0.0525 mg/mL的混合對照品溶液。

精密稱取馬錢苷2.17 mg，用80%甲醇定容至10 mL，搖勻，配制成對照品貯備液，精密移取馬錢苷對照品貯備液2.5 mL，置5 mL棕色量瓶中，加80%甲醇定容至刻度，搖勻制成含馬錢苷0.1085 mg/mL 對照品溶液［6］。

2.2.3 供試品溶液的制備 取1～9號浸膏細粉各0.5 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，稱定質(zhì)量，超聲處理 (150 W，40 Hz)30 min，放冷，再用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液制備 按照處方和工藝制備肉蓯蓉陰性制劑、山茱萸陰性制劑，再按供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。

（3）采用變分基本原理，對采用變分方法如何確定橋梁結構在某特定條件下溫度的具體分布進行了分析，并闡述對溫度場分布實施有效簡化的具體方法。

2.2.5 標準曲線的制備 分別自動進樣毛蕊花糖苷松果菊苷混合對照品溶液 0.5、1、2、3、4、5 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定，以進樣量(X)對色譜峰峰面積 (Y)進行線性回歸，得松果菊苷回歸方程:y=2320526.40x－27943.55(r=0.99999，n=6)，結果表明松果菊苷進樣在51.3～513 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關系;得毛蕊花糖苷回歸方程 y=1227597.37x－2655.52(r=0.99999，n=6)，表明毛蕊花糖在進樣質(zhì)量濃度為26.3～263 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關系。

分別自動進樣質(zhì)量濃度為0.1086 mg/mL的馬錢苷對照品溶液 0.5、1、2、3、4、5 μL，按“2.2.1”項色譜條件測定，以進樣量 (X)對色譜峰峰面積 (Y)進行線性回歸，得回歸方程:y=3026418.27x－1180.81(r=0.99998，n=6)。結果表明馬錢苷在54.3～543 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關系。

2.2.6 專屬性試驗 分別自動進樣各對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各1 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定。從圖中可以看出，供試品色譜在與對照品色譜相同保留時間相應的位置上有色譜峰，陰性對照品在與對照品相同的相同保留時間相應的位置上無色譜峰。說明供試品中其他組分對測定結果無影響，陰性無干擾，色譜圖見圖1、圖2。

圖1 混合對照品 (A)、樣品 (B)、缺肉蓯蓉陰性樣品(C)圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，sample(B)，sample without Cistanches Herba(C)

圖2 馬錢苷對照品 (A)、樣品 (B)、缺馬錢苷陰性樣品 (C)圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of loganin(A)，sample(B)，sample without Corni Fructus(C)

2.2.7 精密度試驗 取松果菊苷毛蕊花糖苷總混合對照品溶液，自動連續(xù)進樣6次，每次1 μL，記錄峰面積，松果菊苷、毛蕊花糖苷的RSD值分別為1.09%、1.85%;取馬錢苷對照品溶液，自動連續(xù)進樣6次，每次1 μL，記錄峰面積，RSD為1.87%，RSD值均小于2%，表明儀器的精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 取7號浸膏粉末6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，自動進樣1 μL，按色譜條件測定松果菊苷和毛蕊花糖苷峰面積，結果松果菊苷、毛蕊花糖苷、馬錢苷平均含有量分別為3.104、1.064、3.031 mg/g，RSD分別為 1.25%、1.97%、0.82%，RSD值均小于2%，表明本方法重復性良好。

表3 加樣回收率試驗結果 (n=9)Tab.3 Results of recovery tests(n=9)

2.2.10 供試品中松果菊苷、毛蕊花糖苷、馬錢苷的測定 分別自動進樣各號供試品溶液1 μL，按“2.2.1”項下色譜條件檢測，測定結果見表4。

2.3 浸膏得率的計算 將所得各組提取液均濃縮至200 mL，分別取50 mL于蒸發(fā)皿中，70℃水浴濃縮至稠浸膏，再轉(zhuǎn)移至烘箱中70℃真空干燥至恒定質(zhì)量，干燥器中冷卻，迅速稱定質(zhì)量，計算干膏得率，結果見表4。

表4 正交試驗結果Tab.4 Results of orthogonal design

2.4 正交試驗結果與分析 計算每組樣品中松果菊苷和毛蕊花糖苷總含有量、馬錢苷含有量、浸膏得率，并進行綜合評分 (其權重系數(shù)分別為:0.5、0.3、0.2)［5］，以綜合評分為標準，直觀分析表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素對有效成分提取量影響主次為A＞D＞B＞C，即乙醇體積分數(shù)＞煎煮次數(shù)＞加醇倍量＞煎煮時間，直觀分析優(yōu)選出組合為A3B3C1D2，試驗結果及直觀分析詳見表4。

2.5 正交試驗方差分析結果 對試驗結果進行方差分析，結果表明，乙醇體積分數(shù)%(A)、煎煮次數(shù) (D)對實驗結果影響顯著 (P＜0.05)，加醇倍量 (B)、煎煮時間 (C)對實驗結果均無顯著影響，優(yōu)選出組合為A3B3C1D2，與直觀分析結果相符合，即:加10倍量的80%的乙醇，提取兩次，每次1.0 h，方差分析結果見表5。

表5 方差分析Tab.5 Results of variance analysis

2.6 工藝驗證 為進一步考察優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，按照優(yōu)選出的最佳工藝進行3次驗證試驗，結果表明:按提取工藝A3B3C1D2進行提取，松果菊苷與毛蕊花糖苷含有量之和、馬錢苷的含有量和干膏得率的結果差異較小，重復性較好，結果見表6。

表6 工藝驗證試驗Tab.6 Results of the test under optimized conditions

3 討論

3.1 指標成分的選擇 蓯歸益腎膠囊為中藥復方制劑，處方由肉蓯蓉、山茱萸等六味中藥組成，肉蓯蓉為方中君藥，現(xiàn)代藥理研究顯示，其所含苯乙醇苷類成分松果菊苷、毛蕊花糖苷均是主要活性成分和質(zhì)量控制的指標性成分，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、增強記憶等作用，與中醫(yī)傳統(tǒng)理論肉蓯蓉具有補腎陽、益精血、潤腸燥、通便之功效相契合，醇提法可有效提取其活性成分［7-9］;臣藥山茱萸中環(huán)烯醚萜總苷能夠抑制免疫作用、抗炎、抗血栓等，減輕氧化應激損傷，有效對抗糖尿病血管并發(fā)癥，與肉蓯蓉合用有協(xié)同作用［10-11］。因此，從君藥、臣藥中分別選取有效成分作為指標有助于全面的評價提取工藝。

3.2 UPLC色譜條件的建立 本實驗采用UPLC-PDA雙通道檢測技術，可同時測定君藥肉蓯蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷及臣藥山茱萸中馬錢苷含有量，流動相選擇和溶劑梯度的設置最初參照2010年版《中國藥典》一部中肉蓯蓉含量測定方法，但所得基線不平穩(wěn)，分離度不理想，據(jù)分析與供試品中成分較為復雜有關，為兼顧松果菊苷、毛蕊花糖苷、馬錢苷的測定，結合UPLC的特點，經(jīng)過多次預實驗，增加梯度設置，有助于更好地分離供試品中成分，選擇的梯度洗脫方法快速、穩(wěn)定、分離度好、測定數(shù)值較準確。

3.3 實驗結果分析 本實驗通過正交設計優(yōu)選的蓯歸益腎膠囊最佳提取工藝為為:加10倍量的80%乙醇，提取兩次，每次1.0 h。研究顯示，肉蓯蓉中苯乙醇苷類化合物易發(fā)生氧化及水解而被破壞，松果菊苷、毛蕊花糖苷等腎臟保護有效成分隨著煎煮時間的延長呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢［12］。這與本實驗顯示的煎煮1 h有效成分含有量高于提取1.5 h和2 h的現(xiàn)象一致，提示了科學優(yōu)選中藥制劑生產(chǎn)工藝具有重要意義，能有效節(jié)省時間和能源，并有助于提升藥品的質(zhì)量，提高制劑穩(wěn)定性和有效性［13］。工藝驗證試驗與正交試驗結果基本一致，證明優(yōu)選最佳工藝穩(wěn)定、重復性好，為該制劑的提取工藝參數(shù)確定提供了實驗依據(jù)，為該制劑中藥新藥的開發(fā)奠定了一定的基礎。

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