新疆不同產(chǎn)地紅花質(zhì)量評(píng)價(jià)

劉雅新，劉珊珊，譚 勇，陳 文

(新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002)

紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥管狀花，味辛性溫，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效［1］。紅花化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有查爾酮類色素、黃酮類、酚酸類、甾體類及多糖類等化合物［2-5］。由于紅花獨(dú)特的藥理作用［6-8］，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紅花的需求量日益增加，而新疆紅花的種植面積和產(chǎn)量占全國(guó)的80%［9］，因此控制新疆紅花藥材的內(nèi)在質(zhì)量［10］以及發(fā)展新疆紅花道地藥材的生產(chǎn)已成為當(dāng)務(wù)之急，而有關(guān)新疆不同產(chǎn)地紅花質(zhì)量評(píng)價(jià)的文獻(xiàn)目前還沒(méi)有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)新疆32批不同產(chǎn)地的紅花質(zhì)量進(jìn)行了系統(tǒng)的分析與評(píng)價(jià)，采用《中國(guó)藥典》“紅花”項(xiàng)下有效成分檢測(cè)指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定并比較新疆不同產(chǎn)地紅花中羥基紅花黃色素A與山柰素的量，同時(shí)對(duì)10批新疆不同產(chǎn)地紅花進(jìn)行了HPLC指紋圖譜的對(duì)比研究，旨在為評(píng)價(jià)新疆不同產(chǎn)地紅花的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，為篩選出優(yōu)良的紅花產(chǎn)地和實(shí)施GAP奠定重要基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);Sartorius BP211D十萬(wàn)分之一分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);Sartorius分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);CF-16RX高速離心機(jī)(日本日立科學(xué)儀器有限公司)。

羥基紅花黃色素A對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111637-200503);山柰素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110861-200606);紅花樣品(產(chǎn)地新疆);甲醇、乙腈為色譜純;磷酸為分析純;蒸餾水與雙蒸水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 羥基紅花黃色素A的測(cè)定［1］

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸水溶液(26∶2∶72);檢測(cè)波長(zhǎng)403 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量20μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱定，加25%甲醇制成0.51 mg/mL的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取紅花粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1，羥基紅花黃色素A測(cè)定結(jié)果見表1。

圖1 羥基紅花黃色素A(A)對(duì)照品和紅花樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of hydroxysafllor yellow A(A)and safflower sample(B)

表1 新疆不同產(chǎn)地紅花中羥基紅花黃色素A和山柰素Tab.1 Hydroxysafllor yellow A and kaempferide content in safflower from different habitats in Xinjiang

2.2 山柰素的測(cè)定［1］

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液(52∶48);檢測(cè)波長(zhǎng)367 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量20μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取山柰素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.08 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取紅花粉末0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液15 mL，置平底燒杯中，加鹽酸溶液(15→37)5 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖2，山奈素測(cè)定結(jié)果見表1。

2.3 新疆不同產(chǎn)地紅花HPLC指紋圖譜的建立［11-15］及對(duì)比研究

2.3.1 色譜條件 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 min，5%A;55 min，25%A;65 min，5%A);檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量20μL。

圖2 山柰素對(duì)照品(A)和紅花樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of kaempferide(A)and safflower sample(B)

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成2.50 mg/mL的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取紅花粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.4 g，加入水50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W頻率59 kHz)60 min，放冷再稱定，補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取同一份紅花樣品的供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)指紋圖譜。以羥基紅花黃色素A為參比峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均在3%以下，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批紅花樣品5份，按供試品溶液的制備方法分別制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，以羥基紅花黃色素A為參比峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積值的RSD均在3%以下，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份紅花樣品作為供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h檢測(cè)指紋圖譜，以羥基紅花黃色素A為參比峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積值的RSD均在3%以下，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜檢測(cè)要求。

2.3.7 新疆不同產(chǎn)地紅花指紋圖譜的建立 在同一個(gè)色譜條件下，對(duì)收集的10批新疆不同產(chǎn)地紅花進(jìn)行測(cè)定，比較各樣品的HPLC指紋圖譜(圖3)，得20個(gè)共有特征峰(圖4)，因此確定這20個(gè)峰為共有指紋峰。

圖3 10批新疆不同產(chǎn)地紅花HPLC指紋圖譜Fig.3 Fingerprint graphics of 10 batches safflower samples from different habitats in Xinjiang

圖4 新疆紅花指紋圖譜特征峰Fig.4 Fingerprint characteristic peak of safflower sample from different habitats in Xinjiang

2.3.8 新疆不同產(chǎn)地紅花指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)由32批新疆不同產(chǎn)地紅花中羥基紅花黃色素A與山柰素的測(cè)定結(jié)果可知，塔城、伊犁、昌吉、和田與喀什地區(qū)內(nèi)羥基紅花黃色素A與山柰素的量相差不大，但不同地區(qū)之間有明顯差異，因此分別選擇2批塔城、伊犁、昌吉、和田與喀什地區(qū)的紅花樣品，測(cè)定10批新疆不同產(chǎn)地的紅花藥材，記錄指紋圖譜，并采用“計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件(2004A)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，10批新疆不同產(chǎn)地紅花藥材的相似度均在0.95以上(見表2)。

2.3.9 樣品主成分聚類分析 本實(shí)驗(yàn)采用已建立的紅花藥材指紋圖譜色譜條件，對(duì)10批新疆不同產(chǎn)地的紅花藥材進(jìn)行了指紋圖譜聚類判別分析，將各色譜峰相對(duì)峰面積與樣品號(hào)建立矩陣，應(yīng)用SPSS 19.0軟件，采用組間均聯(lián)法，以歐氏距離為測(cè)度，得到紅花藥材的聚類譜系圖(圖5)。由聚類分析結(jié)果圖可以看出，10批新疆不同產(chǎn)地紅花共聚為四個(gè)大類。其中北疆昌吉地區(qū)木壘縣東城鎮(zhèn)與北疆昌吉地區(qū)奇臺(tái)縣半截溝鎮(zhèn)為一類，南疆和田洛浦縣山普魯鄉(xiāng)與南疆和田策勒縣策勤鄉(xiāng)為第二類，南疆喀什葉城縣鐵提鄉(xiāng)與南疆喀什英吉沙縣城關(guān)鄉(xiāng)為第三類，北疆塔城地區(qū)164團(tuán)、北疆塔城地區(qū)多拉特鄉(xiāng)、北疆伊犁地區(qū)果子溝與北疆伊犁地區(qū)察縣四鄉(xiāng)為第四類。

表2 10批新疆不同產(chǎn)地紅花指紋圖譜間的相似度Tab.2 Similarity analysis of 10 batches safflower samples from different habitats in Xinjiang

圖5 10批新疆不同產(chǎn)地紅花聚類分析結(jié)果圖Fig.5 Hierarchical clustering result of 10 batches safflower samples from different habitats in Xinjiang

3 討論

3.1 由32批產(chǎn)自新疆不同地區(qū)的紅花樣品中羥基紅花黃色素A的測(cè)定結(jié)果可知，大部分產(chǎn)地紅花樣品中羥基紅花黃色素A的量高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，昌吉地區(qū)紅花樣品的羥基紅花黃色素A量最高，和田地區(qū)紅花樣品的羥基紅花黃色素A量最低，其中和田策勤縣紅花樣品的羥基紅花黃色素A量?jī)H為0.93%，低于國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)，北疆地區(qū)紅花樣品的羥基紅花黃色素A量高于南疆地區(qū)紅花樣品。因此，在選擇紅花的種植區(qū)域時(shí)，因考慮種植地區(qū)對(duì)紅花有效成分的影響，由此可知，昌吉地區(qū)可作為紅花的最佳種植區(qū)域。

3.2 由32批產(chǎn)自新疆不同地區(qū)的紅花中山柰素的測(cè)定結(jié)果可知，昌吉地區(qū)紅花樣品山柰素的量最高，和田地區(qū)紅花樣品的山柰素量最低，低于國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)，北疆產(chǎn)地紅花樣品中山柰素量高于南疆產(chǎn)地樣品。由以上結(jié)果可知，昌吉地區(qū)可作為種植紅花的最佳區(qū)域。

3.3 根據(jù)10批不同產(chǎn)地紅花樣品指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可知，本實(shí)驗(yàn)收集的新疆不同產(chǎn)地紅花主要峰群整體圖貌基本一致，共有峰相對(duì)保留時(shí)間基本一致，所含的主成分基本相似，而不同產(chǎn)地紅花的相對(duì)峰面積差異較大，其中昌吉地區(qū)的相對(duì)峰面積最大，和田地區(qū)的相對(duì)峰面積最小，說(shuō)明不同產(chǎn)地的環(huán)境、氣候等因素對(duì)紅花藥材中各種成分的量有較大影響。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:157．

［2］王若菁，楊 濱．紅花的化學(xué)成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007，13(5):65-69．

［3］劉玉明，楊峻山，劉慶華．紅花化學(xué)成分研究［J］．中藥材，2005，28(4):288-289．

［4］李艷梅，車慶民．紅花化學(xué)成分的研究［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，1998，33(8):626-628．

［5］尹宏斌，何直升，葉 陽(yáng)．紅花化學(xué)成分的研究［J］．中草藥，2001，32(9):776-778．

［6］戎惠珍．紅花的化學(xué)成分及藥理研究概況［J］．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，9(4):45．

［7］吳 偉，金 鳴，楊樹東，等．紅花總黃素抑制血小板激活因子所致毛細(xì)血管通透性增加的研究［J］．心肺血管病雜志，1999，18(4):281．

［8］陳 夢(mèng)，趙丕文，孫艷玲，等．紅花及其主要成分的藥理作用研究進(jìn)展［J］．環(huán)球中醫(yī)藥，2012，5(7):556-560．

［9］楊 輝，阿依吐倫·斯馬義．羥基紅花黃色素A的提取及含量測(cè)定［J］．新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31(10):1358-1360．

［10］Guidance for industry．Botanical drug products［M］．Draft Guidance:CDER/FDA，2000．

［11］宋金春，胡傳芹，曾俊芬，等．紅花的HPLC指紋圖譜研究［J］．中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40(18):1378-1380．

［12］謝國(guó)祥，邱明豐，張漢杰，等．利用高效液相色譜建立紅花的色譜指紋圖譜［J］．中成藥，2007，29(8):1093-1097．

［13］國(guó)家藥品監(jiān)督管理局．中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)［S］．2000:3-7．

［14］周曉英，張立新，張 良，等．紅花的指紋圖譜分析方法研究［J］．中成藥，2002，24(5):325-327．

［15］胡 燕，王文波，宋力飛，等．紅花HPLC指紋圖譜研究［J］．湖南中醫(yī)雜志，2013，29(3):110-112．