一測多評法測定黃柏中5種生物堿

吳珊珊，胡昌江，呂非非，高 源，李文兵

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 611137)

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效［1］，為臨床常用藥物。其主要成分有小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、巴馬汀、藥根堿等生物堿類，其中含有量最高的為小檗堿［2-4］?，F(xiàn)代藥理研究表明，鹽酸小檗堿具有抗炎，降血壓，降血糖和免疫調(diào)節(jié)等作用，黃柏堿與降壓作用有關(guān)，而巴馬汀、藥根堿為抗病原微生物的有效成分［5-6］。2010年版《中國藥典》以小檗堿和黃柏堿的量作為黃柏質(zhì)量控制指標(biāo)，尚不能全面反應(yīng)黃柏的質(zhì)量。目前，雖有文獻(xiàn)報道，采用HPLC法同時測定黃柏中多種生物堿的量［7-8］，但需要多種對照品，限制了實際工作中的應(yīng)用。

本實驗以小檗堿為參照物，得出黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀與小檗堿之間的相對校正因子(F)，同時測定了黃柏中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量，建立一測多評法(QAMS)［9-17］，從而降低檢測成本和時間，提高方法的實用性。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相系統(tǒng)，Shimadzu LC-20AT高效液相系統(tǒng)，F(xiàn)E20梅特勒-托利多pH計，Sartorius BP211D電子分析天平，KQ-300E超聲儀(40 kW)，乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

木蘭花堿(Must-12022901)、鹽酸黃柏堿(Must-12021407)、鹽酸藥根堿(Must-10122001)、鹽酸巴馬汀(Must-11122703)和鹽酸小檗堿(Must-111212110)均購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度為98%。黃柏樣品1～3號購自廣西，4～7號購自貴陽，8～9號購自湖北，10號購自湖南，11～30號購自四川滎經(jīng)、青城山、都江堰、彭州、瀘州等地藥材市場和不同的飲片公司。經(jīng)本校生藥室教研室盧先明教授鑒定為黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮。

2 分析方法與結(jié)果

2.1 一測多評方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，Thermo C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，Diamonsil C18(2)(4.6 mm×250 mm，5μm)。柱溫 30 ℃，體積流量1mL/min，檢測波長280 nm，流動相A為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(KH2PO4)(45∶55)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH至4.8)，流動相 B為乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(55∶45)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH至4.5)，梯度洗脫，0～12 min(0 B)，12～18 min(0～100%B)，18～40 min(100%B)，40～42 min(100% ～0 B)，42～48 min(0 B)。上述色譜條件下，各組分分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)和樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and samples(B)

2.1.2 對照品溶液的制備 取木蘭花堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿5種生物堿，精密稱定 10.24、9.8、9.09、10.92、14.42 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。再稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度。精密移取稀釋后的5個對照品溶液適量配為混合對照品溶液。將上述溶液保存于4℃冰箱中備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取黃柏藥材粉末(過4號篩)約0.5 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液40 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，冷卻后加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液補(bǔ)足失質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液過0.45μm 濾膜，5μL 進(jìn)樣。

2.1.4 線性范圍考察 精密吸取上述混合對照品溶液40、20、10、8、6、4、2、1μL，進(jìn)樣分析，每個質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，取平均值。以進(jìn)樣量對峰面積積分值進(jìn)行回歸處理，得小檗堿、木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

表1 黃柏中5種生物堿類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 Standard curves of five alkaloids

2.1.5 校正因子計算 以小檗堿為內(nèi)標(biāo)，計算小檗堿對木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的校正因子，見表2。

表2 黃柏生物堿相對校正因子Tab.2 Relative correction factors(RCF)of alkaloids

2.1.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5μL于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的峰面積，得出日內(nèi)精密度分別為 0.68%、0.74%、1.30%、0.93%和0.81%。表明儀器較為穩(wěn)定。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液5μL分別于配制后的0、2、4、8、12、24、48 h測定峰面積，計算得木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿穩(wěn)定性的 RSD分別為0.66%、0.34%、0.38%、0.11%和0.63%。表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗 稱取黃柏藥材粉末(過4號篩)約0.5 g共6份，精密稱定，按“2.1.3”項下制備樣品，測定，木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的 RSD分別為1.9%、2.5%、1.3%、1.2%和2.2%。表明該方法重復(fù)性好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱取0.5 g湖北產(chǎn)黃柏藥材粉末(小檗堿含有量3.81%)6份，加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液40 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，冷卻后加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液補(bǔ)足失質(zhì)量，過濾，取濾液2 mL，加1 mL鹽酸小檗堿(1.007 mg/mL)定容到10 mL，再次超聲30 min(重現(xiàn)提取過程)，0.45μm濾膜過濾，進(jìn)樣，測定，計算，得加樣回收率分別為97.1%、98.8%、 96.9%、 100.9%、 99.0%、 95.6%、RSD為1.9%。

2.2 校正因子的重現(xiàn)性考察

2.2.1 色譜柱及高效液相色譜儀考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，進(jìn)樣20、10、8、6、4、2μL，按“2.1.5”項下計算小檗堿對木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的校正因子。不同高效液相色譜系統(tǒng)和不同品牌柱子的相對校正因子見表3。

2.2.2 待測組分色譜峰的定位 利用5個成分色譜行為的不同，以小檗堿為基準(zhǔn)峰計算各個化合物的相對保留時間，即確定其在色譜圖中的位置。結(jié)果見表4。

表3 不同儀器和色譜柱測得相對校正因子Tab.3 RCFs determined by different instruments and columns

表4 不同儀器和色譜柱測得相對保留值Tab.4 Relative retention time(RTR)determined by different instruments and columns

2.3 一測多評法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定結(jié)果的比較按供試品溶液處理方法制備樣品，分別精密吸取供試品溶液各5μL注入高效液相色譜儀測定。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測多評法分別計算黃柏中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量，結(jié)果見表5。

測定結(jié)果表明，同一樣品中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量差異較大，小檗堿的量最高，部分地區(qū)不含或含少量藥根堿和巴馬汀。同時，不同產(chǎn)地黃柏生物堿量差異比較大，川產(chǎn)黃柏小檗堿和黃柏堿量較其他產(chǎn)區(qū)高，其中以四川滎經(jīng)產(chǎn)黃柏含有量最高。

3 討論

實驗過程中，考察了鹽酸-甲醇(1∶100)、乙酸-甲醇(1∶100)、60%乙醇和甲醇4種不同提取溶劑，采用超聲提取30 min，權(quán)衡5種成分提取效率，結(jié)果以鹽酸-甲醇(1∶100)作為溶劑提取較為完全。同時，考察了乙腈-磷酸鹽溶液作為流動相系統(tǒng)進(jìn)行分析，其峰型較差，色譜峰重疊，改為乙腈-磷酸二氫鉀(十二烷基硫酸鈉，磷酸調(diào)節(jié)pH)后，峰型改善，但木蘭花堿和黃柏堿色譜峰重疊，無法得到有效分離。因為將木蘭花堿與黃柏堿、巴馬汀與小檗堿同時有效分離需要不同濃度的有機(jī)相和不同pH。因此，考察不同pH不同乙腈濃度的混合流動相作為洗脫劑，最后實驗確定以乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(45∶55)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH至4.8)為流動相A，乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(55∶45)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH至4.5)為流動相B，作為流動相，使各成分完全分離，且峰形較好。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測多評法測定黃柏中生物堿的比較Tab.5 Contents of alkaloids by external standard method and QAMS

本實驗考察了不同色譜柱、液相色譜系統(tǒng)對小檗堿與木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿和巴馬汀之間相對校正因子的影響，驗證一測多評法在黃柏質(zhì)量控制中的可行性和技術(shù)適應(yīng)性。標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測多評法測定30批黃柏中生物堿的結(jié)果表明，一測多評法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到的數(shù)值之間沒有顯著性差異，說明建立的校正因子具有較好的可信度，一測多評法能同時測定黃柏中小檗堿、木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿和巴馬汀的量。

實驗中，通過對5個成分的吸收光譜并結(jié)合3D圖進(jìn)行分析，選擇280 nm作為檢測波長，5個生物堿都有吸收。黃柏堿及木蘭花堿與另3個生物堿母核結(jié)構(gòu)不同(巴馬汀、藥根堿、小檗堿)，UV響應(yīng)值也存在不同，但一測多評法利用數(shù)學(xué)上的轉(zhuǎn)換關(guān)系推算校正因子，并不關(guān)乎化學(xué)結(jié)構(gòu)是否異同，故而雖然每個成分都不能實現(xiàn)最優(yōu)的波長檢測，但在一定含有量范圍內(nèi)仍然是可以實現(xiàn)較為準(zhǔn)確的定量。

黃柏中小檗堿與其他生物堿相比含有量差異很大，一次分離測定常導(dǎo)致低含有量成分低于檢測靈敏度或超出線性范圍，很難同時兼顧。同時，多組分定量測定中無法兼顧各組分選用最佳波長，確實會降低各組分的定量限，但在本實驗中的30個樣品中并未受到該因素的影響，相比每個成分單獨(dú)測定而言，換來了較高的分析效率。在對照品缺乏的情況下，此方法可以作為一個新模式用于黃柏藥材的多成分定量。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:286.

［2］龔千鋒.中藥炮制學(xué)［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003:220-221.

［3］李行諾，翟文豐，周孟宇，等.黃柏化學(xué)成分研究［J］.浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，20012，40(3):244-246.

［4］劉仁俊.黃柏化學(xué)成分及藥理作用淺談［J］.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9(13):83-84.

［5］鄭洪艷.小檗堿藥理作用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2004，35(6):708-711.

［6］肖培根.新編中藥志:第3卷［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002:664-670.

［7］范積平，張貞良，廖曉玲，等.不同產(chǎn)地黃柏藥材中4種主要生物堿類成分的含量測定［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報，2010，26(1):54-57.

［8］張 莉，潘 超.高效液相色譜法同時測定二妙丸中鹽酸小檗堿和黃柏堿的含量［J］.實驗研究，2011，20(22):2262-2264.

［9］王智民，高慧敏，付雪濤，等.一測多評法中藥質(zhì)量評價模式方法學(xué)研究［J］.中國中藥雜志，2006，31(23):1925-1928.

［10］王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測多評法建立的技術(shù)指南［J］.中國中藥雜志，2011，36(6):657-658.

［11］匡艷輝，朱晶晶，王智民，等.一測多評法測定黃連中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44(5):390-394.

［12］朱晶晶，王智民，匡艷輝，等.一測多評法同步測定人參和三七藥材中多種人參皂苷的含量［J］.藥學(xué)學(xué)報，2008，43(12):1211-1216.

［13］吳鐵榮，許 妍，羅躍華，等.一測多評法同步測定腫節(jié)風(fēng)藥材中 6種成分［J］.中藥材，2011，34(11):1730-1734.

［14］蔡海霞，陳 君，李 萍.一測多評法測定黃芪中4種異黃酮的含量［J］.中國中藥雜志，2010，35(20):2712-2717.

［15］朱晶晶，王智民，張啟偉，等.一測多評法同時測定黃芩藥材中4種黃酮類成分的含量［J］.中國中藥雜志，2009，34(24):3229-3234.

［16］王鈺瑩，馮偉紅，楊 菲，等.一測多評法測定三黃片中的大黃蒽醌類成分［J］.中國中藥雜志，2012，37(2):212-217.

［17］吉麗娜，馮偉紅，王智民，等.一測多評法與外標(biāo)法測定三黃片中4種黃芩黃酮類成分［J］.中成藥，2012，34(11):2128-2133.