糖皮質(zhì)激素受體α調(diào)節(jié)劑高通量篩選模型的建立及應(yīng)用

孫彩霞，張振亮，鄭海洲，路新華，鄭智慧，趙寶華，段寶玲

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糖皮質(zhì)激素受體α調(diào)節(jié)劑高通量篩選模型的建立及應(yīng)用

孫彩霞，張振亮，鄭海洲，路新華，鄭智慧，趙寶華，段寶玲

050016 石家莊，河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（孫彩霞、張振亮、鄭智慧、趙寶華）；050013 石家莊，華北制藥集團(tuán)新藥開發(fā)有限責(zé)任公司（鄭海洲、路新華、鄭智慧、段寶玲）

建立不同分子作用機(jī)制的糖皮質(zhì)激素受體α（GRα）調(diào)節(jié)劑高通量篩選模型，篩選新型糖皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)劑。

克隆 GRα 的配體結(jié)合域 LBD 和全長基因，構(gòu)建哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pBIND-GAL4-GRα LBD、pTARGET- GRα，分別與已構(gòu)建的含 GAL4 響應(yīng)元件 5 × UAS 的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒 p5 × UAS-luc 和含有 4 × GRE 的報(bào)告質(zhì)粒 pGRE-luc 共轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞，建立兩種不同機(jī)制的報(bào)告基因細(xì)胞篩選方法，通過報(bào)告基因的表達(dá)檢測化合物對 GRα 受體轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的調(diào)節(jié)劑作用；利用實(shí)時定量 PCR 方法進(jìn)一步驗(yàn)證化合物對糖皮質(zhì)激素受體靶基因 mRNA 水平的調(diào)控作用。

經(jīng)過分別共轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告質(zhì)粒，GRα 激動劑地塞米松可劑量依賴地誘導(dǎo) 5 × UAS-luc 和 4 × GRE-luc 兩個模型的熒光素酶的表達(dá)，在 5 × UAS-luc 模型中，最大上調(diào)倍數(shù)可達(dá)（9.0 ± 0.2）倍，EC50值為（0.28 ± 0.07）mmol/L，Z' 因子為 0.52。在 4 × GRE-luc 模型中，最大上調(diào)倍數(shù)可達(dá)（3.2 ± 0.3）倍，EC50值為（1.81 ± 0.13）mmol/L，Z' 因子為 0.49。利用模型 pBIND-GAL4-GRα LBD/p5 × UAS-luc 從 2000 多個微生物和植物來源的天然以及合成化合物中篩選得到 1 個微生物來源的天然產(chǎn)物黑麥酮酸D，黑麥酮酸D 對 GRα 具有 2 ~ 3 倍的激動活性。進(jìn)一步的定量 PCR 的結(jié)果說明黑麥酮酸D 能有效上調(diào)多個 GRα 調(diào)控的靶基因的表達(dá)。

兩種報(bào)告基因篩選方法靈敏、穩(wěn)定，可以用于 GRα 調(diào)節(jié)劑的高通量篩選。

糖皮質(zhì)激素受體 α； 生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑； 降血糖藥； 高通量篩選

糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）是核受體家族中的重要成員，是一種可溶性單鏈多肽組成的磷蛋白[1]，也是一種典型的激素依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[2]，與激素結(jié)合后通過和靶基因中糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（glucocorticoid receptor response element，GRE）相互作用，對靶基因的表達(dá)起到調(diào)節(jié)效果，最終引起各種生物學(xué)效應(yīng)[3-4]。GR 被報(bào)道參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，具有抗炎、免疫、促細(xì)胞凋亡、參與糖代謝等作用[5-9]。GR 的調(diào)節(jié)劑（激動劑和拮抗劑）被用于哮喘、炎癥、免疫、肺栓性肺炎（COPD）、糖尿病等疾病治療。Horizon 制藥公司的強(qiáng)的松，能治療關(guān)節(jié)炎、平喘、慢性梗阻性肺部疾病并且有止痛作用。目前國際上仍有制藥公司進(jìn)行新的 GR 調(diào)節(jié)藥物的研究開發(fā)。

本研究為了發(fā)現(xiàn)和研究新的 GR 調(diào)節(jié)劑，研制和開發(fā)新的 GR 調(diào)節(jié)劑候選藥物，基于 GR 的作用機(jī)制，利用分子生物學(xué)技術(shù)建立了細(xì)胞水平報(bào)告基因 GRα（GR 的一種亞型）調(diào)節(jié)劑高通量篩選模型[10]。本文主要對篩選方法的建立、驗(yàn)證及篩選結(jié)果進(jìn)行報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞株 pGEM-T easy 載體購于美國 Promega 公司；pBIND 啟動子載體、 pTARGET、HeLa 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；GRE-luc 報(bào)告質(zhì)粒購于上海碧云天公司；p5 × UAS-luc 報(bào)告質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[10]。

1.1.2 主要儀器 GeneAmp PCR System 為美國Backman 公司產(chǎn)品；HERA cell CO2培養(yǎng)箱為美國科峻儀器公司產(chǎn)品；1420 Victor2 多標(biāo)計(jì)數(shù)儀為美國 PE 公司產(chǎn)品；ABI Prism 7000 real time PCR 儀為美國 ABI 公司產(chǎn)品。

1.1.3 工具酶與主要試劑 Ex-Taq、DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)、λ-DNAd III分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA Ligation Kit、SYBR Premix EX Taq 購于寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶H I、I、Luciferase Assay System 購于普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；QIAGEN-tip100 購于德國Qiagen 公司；新生牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司；PRMI 1640 培養(yǎng)液購于美國Hyclone 公司；無酚紅 PRMI 1640 培養(yǎng)液購于美國Gibco 公司；lipofectamine 2000、Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶購于美國 Invitrogen 公司；人腦海馬回總 RNA 購于美國Clontech 公司；地塞米松購于天津天藥藥業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GRα LBD 片段和全長片段的擴(kuò)增 用 Superscript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒對人腦海馬回總 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR，GRα LBD 基因的上游引物和下游引物分別為：5' A GAGGATCCATGTTCCTGCAAC 3'，5' TCCGGTA CCTCACTTTTGATGA 3'。GRα LBD 片段 PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 10 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；反應(yīng)終止于 4 ℃。GRα 全長序列的上游引物和下游引物分別為：5' ATTGGAT CCTTGCCGCCACCATGGACTCCAA 3'，5' ACCGG TACCTCACTTTTGATGAAACAGAAGTT 3'。GRα 全長序列的 PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，58 ℃退火 35 s，72 ℃延伸3 min 10 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；反應(yīng)終止于 4 ℃。

1.2.2 pBIND-GRα LBD、pTARGET-GRα 質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和提取 將 PCR 產(chǎn)物連接到 pGEM-T easy 載體，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將序列正確的 GRα LBD 基因片段用HI、I雙酶切并與 pBIND 載體連接，然后進(jìn)行I、HI雙酶切鑒定。將序列正確的 GRα 全長基因序列用HI、I雙酶切并與 pTARGET 連接，然后進(jìn)行I、HI雙酶切鑒定。并用 QIAGEN-tip 100 對兩種質(zhì)粒進(jìn)行大量提取并電泳檢測，以 260 和 280 nm 處的值進(jìn)行質(zhì)粒的定性和定量分析。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用含 10 % 胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素的 PRMI 1640 培養(yǎng)基于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 瞬時轉(zhuǎn)染和報(bào)告基因檢測 將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株以 3 × 105個/ml 細(xì)胞數(shù)接種于 96 孔板，24 h 后將培養(yǎng)液換成含 10% 胎牛血清的無雙抗的PRMI 1640 培養(yǎng)基，用 lipofectamine 2000 將重組質(zhì)粒 pBIND-GAL4-GRα LBD/p5 × UAS-luc或 pTARGET-GRα/GRE-luc 共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。6 h 后加入不同濃度的藥物誘導(dǎo)刺激，DMSO 作為空白對照。給藥 24 h 后裂解細(xì)胞，多標(biāo)計(jì)數(shù)儀檢測熒光素酶的表達(dá)活性。熒光素酶的表達(dá)誘導(dǎo)倍增數(shù)為加藥組的熒光素酶的活性與空白對照（DMSO）的比值。

1.2.5 Z'因子的計(jì)算 Z'因子是用于評價(jià)高通量篩選方法穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)，計(jì)算公式如下：

Z' 因子 = 1–（3 × 加藥孔 luc 值的 SD– 3 × 空白對照孔 luc 值的 SD）/（加藥孔 luc 平均值–空白對照孔 luc 平均值）。

Z'因子值的范圍在 0 ~ 1 之間，對細(xì)胞水平的篩選模型，當(dāng) Z'> 0.4 被認(rèn)為該方法較穩(wěn)定，適用于高通量藥物篩選。

1.2.6 Real time-PCR 分析活性化合物黑麥酮酸D 對 GRα 靶基因的誘導(dǎo)效應(yīng) 用 LO2細(xì)胞鋪 6 孔板，在細(xì)胞密度達(dá)到 95% 后，用終濃度 0.015 mmol/L 的黑麥酮酸 D 處理。24 h 后 Trizol 法提取細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以此為模板進(jìn)行real time-PCR。

以 GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參，檢測黑麥酮酸D 對 GRα 靶基因凝血因子II（coagulation factor II receptor precusor，F(xiàn)2R）、神經(jīng)肽 Y 受體 Y2（neuropeptide Y receptor Y2，NPY2R）、UL16 結(jié)合蛋白 3（UL16 binding protein 3，ULBP3）、嗅覺受體OR8D4（olfactory receptor，family 8，subfamily D，member 4）的調(diào)節(jié)作用。

用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，所有基因的引物見表 1。Real time-PCR 反應(yīng)條件：①預(yù)變性：95 ℃，30 s；②兩步法 PCR，變性：95 ℃，5 s；退火延伸：60 ℃，34 s；40 個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 GRα LBD 片段和全長基因序列的克隆

用 Superscript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒對人腦海馬回總 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以cDNA 為模板進(jìn)行 GRα LBD 基因和 GRα 全長基因的 PCR 擴(kuò)增，所得 GRα LBD 片段經(jīng)核酸電泳分析，其大小約 750 bp（圖 1），GRα 全長基因的片段大小約 2300 bp（圖 2），與預(yù)期結(jié)果大小相符。

表 1 Real time-PCR 所涉及的基因及其引物序列

bp 1 2 2000 1000750500250100

Figure 1 PCR product of GRα LBD fragment

2.2 表達(dá)載體 pBIND-GRα LBD、pTARGET-GRα 的構(gòu)建

將 GRα LBD 和 GRα 全長基因的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，分別與 pGEM-T easy 載體進(jìn)行連接構(gòu)建成 pGEM-T-GRα LBD、pGEM-T-GRα 克隆載體。用I、HI酶對兩種載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將陽性克隆載體進(jìn)行測序。測序的結(jié)果與 Genebank 報(bào)道的序列進(jìn)行比較，結(jié)果一致。將 pGEM-T-GRα LBD、pGEM-T-GRα 經(jīng)I、HI雙酶切，切下的 GRα LBD 和 GRα 全長基因片段分別與 pBIND promoter 載體和 pTARGET載體連接，構(gòu)建表達(dá)載體。進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果證明表達(dá)質(zhì)粒pBIND-GRα-LBD、pTARGET-GRα 構(gòu)建成功（圖 3 和圖 4）。

2.3 模型的驗(yàn)證

本研究利用 96 孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告質(zhì)粒以 3:1 的比例進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，以地塞米松為陽性對照，DMSO 為陰性對照對模型進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖 5 所示，GRα激動劑地塞米松可劑量依賴地誘導(dǎo)兩個模型的熒光素酶的表達(dá)，對pBIND-GAL4-GRα LBD/p5 × UAS-luc 模型熒光素酶的最大上調(diào)倍數(shù)為 9.0 倍，EC50為0.28 mmol/L，Z'因子為 0.52；對 pTARGET-GRα/GRE 模型熒光素酶的最大上調(diào)倍數(shù)為 3.2 倍，EC50為1.81 mmol/L，Z'因子為 0.49。說明兩個細(xì)胞篩選模型均具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性。

bp 1 2 45003000225015001000750500250

Figure 2 PCR product of GRα

bp 1 2 3bp 2313094166557436123322027 564 2000 1000750500250100

Figure 3 Restriction enzymatic analysis of recombinant vector pBIND-GRα-LBD

bp 1 2 23130941665574361 23322027 564

Figure 4 Restriction enzymatic analysis of recombinant vector pTARGET-GRα

誘導(dǎo)倍數(shù)Fold induction10 8 6 4 2 0 誘導(dǎo)倍數(shù)Fold induction3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 0.001 0.01 0.1 1 10 100 地塞米松濃度（μg/μl）Concentration of dexamethasone (μg/μl)A 地塞米松濃度（μg/μl）Concentration of dexamethasone (μg/μl)B

Figure 5 Effects of agonist dexamethasone on transactivities of GRα (A: 5 × UAS-luc; B: 4 × GRE-luc)

2.4 模型篩選

利用建立的篩選模型，對華北制藥集團(tuán)的 2000 多個來源于微生物、植物以及化學(xué)合成的單體化合物進(jìn)行了初篩和復(fù)篩工作，獲得多個活性化合物，其中從微生物來源的天然產(chǎn)物中篩選得到化合物黑麥酮酸D（圖 6），該化合物對5 × UAS-luc 和 4 × GRE-luc 兩個模型的報(bào)告基因具有較好的轉(zhuǎn)錄激動活性（圖 7）。其最大激活倍數(shù)分別為 2.6 倍和 3.2 倍，EC50分別為 0.27 和 0.68 mmol/L。

圖 6 黑麥酮酸D 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Figure 6 The chemical structure of secalonic acid D

2.5 Real time-PCR 分析黑麥酮酸D 對 GRα 靶基因的誘導(dǎo)效應(yīng)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證黑麥酮酸D 對 GRα 的激動活性，本研究利用 real time-PCR 方法對黑麥酮酸D 對 GRα 的靶基因 F2R、NPY2R、ULBP3、OR8D4 在 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化進(jìn)行了分析研究。結(jié)果如圖 8 所示，經(jīng)過黑麥酮酸 D 處理的細(xì)胞中，GRα、F2R、NPY2R、ULBP3、OR8D4 mRNA 水平的表達(dá)量均明顯上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)分別為處理前的 1.56、2.55、2.11、2.31、2.27 倍，該結(jié)果進(jìn)一步證明了黑麥酮酸 D 對 GRα的激動效應(yīng)。

誘導(dǎo)倍數(shù)Fold induction3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 誘導(dǎo)倍數(shù)Fold induction3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 黑麥酮酸 D 濃度（μg/μl）Concentration of secalonic acid D (μg/μl)A 黑麥酮酸 D 濃度（μg/μl）Concentration of secalonic acid D (μg/μl)B

Figure 7 Effects of secalonic acid D on transactivities of GRα (A: 5 × UAS-luc; B: 4 × GRE-luc)

mRNA 誘導(dǎo)倍數(shù)Fold induction of mRNA level3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 GAPDH GRα F2R NPY2R ULBP3 OR8D4 基因Genes

Figure 8 The mRNA levels of GRα, F2R, NPY2R, ULBP3, OR8D4 in LO2cells treated with secalonic acid D

3 討論

本研究建立了兩種核受體配體活性研究方法：一是哺乳動物單雜交技術(shù)，即將核受體的配體結(jié)合域（LBD）與酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4 的 DNA 結(jié)合域（DBD）融合成嵌合表達(dá)質(zhì)粒，再與含 GAL4 特異響應(yīng)元件 UAS 的報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中，通過測定下游報(bào)告基因表達(dá)量來評價(jià)配體的調(diào)節(jié)功能；二是利用 GRα 的響應(yīng)元件 GRE，與表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，檢驗(yàn)化合物對 GRα 的轉(zhuǎn)錄激動活性，這兩種方法在體外活性測定中可以相互印證。兩個有關(guān)糖皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)劑篩選模型具有一定的創(chuàng)新性，利用地塞米松作為陽性藥，很好地測試了兩個模型的靈敏性和可靠性，另通過篩選獲得一個微生物產(chǎn)物為陽性樣品，并通過考察其相關(guān)靶基因的表達(dá)，確認(rèn)了陽性化合物的相關(guān)活性。

地塞米松是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，是一個已知的 GRα激動劑，臨床用來治療多種炎癥，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牙周炎、足底筋膜炎，也被用來與抗生素合用治療細(xì)菌性腦膜炎和鼻炎等。作為陽性對照藥，地塞米松在本研究建立的兩個模型上具有很好的活性以及良好的劑量依賴關(guān)系，證明了該模型具有高的信躁比、靈敏度和穩(wěn)定性，可以用于 GRα激動劑的篩選。

黑麥酮酸 D 是一個微生物來源的天然產(chǎn)物，已被報(bào)道具有抗真菌和抗腫瘤活性[11]。本研究首次發(fā)現(xiàn)黑麥酮酸D 對 GRα 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用具有激動活性。F2R、NPY2R、ULBP3、OR8D4被報(bào)道是 GRα 的靶基因[12]。F2R、OR8D4 基因與激素代謝，應(yīng)激響應(yīng)有關(guān)；NPY2R 參與機(jī)械性疼痛，對創(chuàng)傷愈合，糖尿病的發(fā)生發(fā)展有影響[13]；許多惡性腫瘤細(xì)胞表面表達(dá) ULBP3，人類相關(guān)腫瘤如慢性 B 型淋巴細(xì)胞白血病、胃腸道腫瘤等的研究均與 ULBP3 有重要關(guān)系[14-15]。本研究的定量 PCR 結(jié)果證實(shí)黑麥酮酸 D 對 GRα 的這幾個靶基因在 mRNA 水平上具有明顯的誘導(dǎo)效應(yīng)，這不僅進(jìn)一步證明黑麥酮酸 D 是 GRα 的激動劑，而且說明了該化合物可能通過 GRα 的激活，在多種生理功能方面具有調(diào)控作用。下一步我們將利用建立的模型繼續(xù)進(jìn)行活性化合物的篩選，并對已篩選到的活性化合物進(jìn)行深入的抗炎及其他藥效的研究。

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Establishment and application of high throughput drug screening models for glucocorticoid receptor α modulators

SUN Cai-xia, ZHANG Zhen-liang, ZHENG Hai-zhou, LU Xin-hua, ZHENG Zhi-hui, ZHAO Bao-hua, DUAN Bao-ling

To develop high throughput screening models for glucocorticoid receptor α (GRα) modulators and discover novel modulators of GRα.

The ligand binding domain (LBD) fragment and full-length gene of GRα were amplified by real time-PCR from human hippocampal total mRNA to construct chimera expression plasmid pBIND-GAL4-GRα LBD and full length express plasmid pTARGET-GRα. The screening models were developed by transfecting the HeLa cells, and the efficiency of modulators on the transactivities of GRα was assayed by measuring the reporter luciferase gene expression. The mRNA levels of targeting genes of GRα in cells were analyzed by real time-PCR.

Dexamethasone, a known GRα agonist, could induce the expression of luciferase in a dose-dependent manner in the both screening models. For the 5 × UAS-luc model, the maximum fold of induction was about (9.0 ± 0.2), the EC50value was about (0.28 ± 0.07) mmol/L, and the parameter Z'-factor value was about 0.52. In the 4 × GRE-luc model, the maximum fold of induction was about (3.2 ± 0.3), the EC50was (1.81 ± 0.13) mmol/L, and the parameter Z'-factor value was 0.49. After screening, one microbial metabolite secalonic acid D from 2000 compounds was identified as a GRα agonist, it could significantly induce the luciferase expression, and the maximum induction folds was about 2 - 3 on both assays. The further real time-PCR results showed that secalonic acid D could increase the mRNA levels of GRα target genes F2R, NPY2R, ULBP3 and OR8D4 in the treated cell line LO2.

The two screening models are robust and sensitive, and can be used to discover the GRα new modulator. Secalonic acid D has been discovered as a new GRα agonist.

Glucocorticoid receptor α; Biological response modifiers; Hypoglycemic agents; High throughout screening

ZHENG Zhi-hui, Email: anzhengzhihui@hotmail.com; ZHAO Bao-hua, Email: zhaobaohua@mail. hebtu.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.005

國家自然科學(xué)基金（81173137）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301002-003）；河北省科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（13272607D）

鄭智慧，Email：anzhengzhihui@hotmail.com；趙寶華，Email：zhaobaohua@mail.hebtu.edu.cn

2013-12-11

Author Affiliations: College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China (SUN Cai-xia, ZHANG Zhen-liang, ZHENG Zhi-hui, ZHAO Bao-hua); New Drug Research & Development Center of North China Pharmaceutical Group Corporation, Shijiazhuang 050015, China (ZHENG Hai-zhou, LU Xin-hua, ZHENG Zhi-hui, DUAN Bao-ling)