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      核磷蛋白NPM1的RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

      2014-10-27 09:04:32王亞楠金蕊張憲馬世良黃君健
      生物技術(shù)通訊 2014年1期
      關(guān)鍵詞:印跡質(zhì)粒載體

      王亞楠,金蕊,張憲,馬世良,黃君健

      1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100850

      RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)以來,它在人類疾病治療方面得到迅速發(fā)展,為某些疾病的治療提供了新的策略。RNA干擾可以使特定的基因沉默,利用RNA干擾治療疾病的優(yōu)勢在于它可以特異而高效地敲除引起疾病的基因的表達(dá)。RNA干擾常用的是小干擾RNA(siRNA)和短發(fā)夾RNA(shRNA)。siRNA可以暫時(shí)降低基因的表達(dá),但隨著細(xì)胞的分裂,siRNA的濃度就會降低,需要經(jīng)常性的轉(zhuǎn)染,很難適應(yīng)細(xì)胞試驗(yàn)中需要長期培養(yǎng)細(xì)胞的需要;而shRNA可以插入RNA干擾載體中,只要shRNA能夠轉(zhuǎn)錄即可對目標(biāo)基因造成長期、穩(wěn)定的敲除作用[1-2]。因此,shRNA干擾越來越受到重視。慢病毒載體可以將外源基因整合到宿主染色體上,同時(shí)其極高的轉(zhuǎn)染效率在臨床研究上效果非常明顯,已得到廣泛應(yīng)用。在本研究中,我們針對人核磷蛋白(nucleophosmin,NPM)NPM1基因,用pll3.7質(zhì)粒載體構(gòu)建了有效的shRNA干擾慢病毒載體,為研究NPM1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及腫瘤的治療提供一個(gè)有力的工具。

      NPM1是NPM家族(包括NPM1、NPM2、NPM3等3種亞基)中重要的一員,又名B23、numatrin或NO38。人NPM1基因定位于染色體5q35,全長約23 kb,含12個(gè)外顯子。NPM1是一種核仁磷酸化蛋白質(zhì),主要分布在核仁區(qū)域[3],參與核糖體的生物合成,控制中心體復(fù)制,具有分子伴侶作用[4-5]。NPM1基因作為調(diào)控中心體復(fù)制起始的關(guān)鍵基因,在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn),在卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等不同腫瘤中,NPM1都呈過表達(dá)水平[8],其還與細(xì)胞分裂次數(shù)和增殖值率密切相關(guān)。這些都表明,NPM的過表達(dá)引發(fā)腫瘤的發(fā)生[9],特別是與造血干細(xì)胞疾病如白血病和淋巴瘤密切相關(guān)[10]。因此,有效地抑制腫瘤細(xì)胞中NPM1的表達(dá),有希望成為靶向治療腫瘤的新途徑。

      1 材料和方法

      1.1 材料

      293T細(xì)胞,HT1080細(xì)胞,大腸桿菌DH5α,質(zhì)粒pll3.7(圖1),包裝載體RRE、REV、VSVG均由本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒提取試劑盒購自Exygen公司;膠回收試劑盒購自北京天根生物公司;限制性內(nèi)切酶HpaⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ,T4DNA連接酶購自NEB公司;RT-PCR相關(guān)試劑、LipofectAMINE 2000購自Invit?rogen公司;NPM1抗體購自Epitomics公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗購自Sigma公司;Western印跡顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;核酸電泳系統(tǒng)、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀均購自Bio-Rad公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

      1.2 靶向NPM1的shRNA設(shè)計(jì)

      根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則,參考GenBank公布的人NPM1(NM_002520),用Invitrogen公司在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)shRNA序列(shRNA對照、shRNA1、shRNA2、shRNA3),進(jìn)行Blast同源性分析,保證序列的惟一性。為方便克隆,在其5′和3′端分別引入HpaⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(為方便鑒定,設(shè)計(jì)時(shí)將酶切位點(diǎn)消掉),反義片段后接終止信號TTTTTT以終止轉(zhuǎn)錄。序列由英駿公司合成,見表1。

      1.3 NPM1干擾載體的構(gòu)建

      將合成的寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA(95℃5 min,72℃ 10 min,自然降至室溫),同時(shí)將shRNA載體pll3.7用HpaⅠ/XhoⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物純化后,把退火形成的DNA雙鏈與酶切回收的線性化載體片段于16℃連接過夜,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,之后將其涂布在氨芐西林抗性的LB平板上,37℃培養(yǎng)過夜,每個(gè)平板挑4個(gè)菌落,擴(kuò)增,提質(zhì)粒,用EcoRⅠ/HpaⅠ酶切鑒定,將已插入shRNA片段的載體送北京博邁德公司測序。

      1.4 293T細(xì)胞的培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

      將293T細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每隔2~3 d將細(xì)胞傳代培養(yǎng);將細(xì)胞鋪6孔板,當(dāng)細(xì)胞融合度為70%~80%時(shí)瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染程序按照LipofectAMINE 2000說明書進(jìn)行,培養(yǎng)48~72 h后收集細(xì)胞。

      1.5 Western印跡檢測shRNA的抑制效果

      圖1 pll3.7 RNA干擾載體質(zhì)粒圖譜

      表1 針對人NPM1基因設(shè)計(jì)的4對shRNA序列

      收集細(xì)胞,用RAPI裂解液裂解細(xì)胞,提取蛋白質(zhì),進(jìn)行SDS-PAGE,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h,用抗NPM1的一抗孵育2 h,用TBST清洗3次,每次5 min,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗孵育1 h,用TBST清洗3次,每次5 min,按照Western印跡顯色試劑盒說明書顯色1~2 min,暗室壓片顯影。

      1.6 慢病毒的包裝與感染

      10 cm皿的細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%~80%時(shí),將慢病毒包裝載體RRE、REV、VSVG與干擾質(zhì)粒依次按4.2、2.1、3.1、4 μg混合,加入氯化鈉注射用水750 μL,混勻;40 μL轉(zhuǎn)染試劑同樣加入氯化鈉注射用水750 μL,混勻;將前兩者混勻,靜置15 min,加入細(xì)胞中,72 h后收上清,用孔徑0.45 μm的濾膜過濾,所獲即為包裝好的病毒,將其感染HT1080細(xì)胞,其余的病毒用小管分裝,-80℃凍存,反復(fù)感染細(xì)胞,直到感染效率達(dá)90%以上。

      1.7 在HT1080細(xì)胞中驗(yàn)證shRNA的干擾效果

      收集感染病毒后的HT1080細(xì)胞,取1/3,提取細(xì)胞總RNA,按照Invitrogen公司的TRIzol試劑提取總RNA 說明書提取 RNA,并將其稀釋到 500 μg/μL。按照Invitrogen公司M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶使用說明書合成cDNA,取上述產(chǎn)物2 μL,按一般方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以β-actin為內(nèi)參基因。β-actin上游引物為5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',下游引物為5'-G CTGTCACCTTCACCGTTCC-3';NPM1 上游引物 為5'-CGGGATCCGAAGATTCGATGGACATGGAC-3',下游引物為5'-ATATGCGGCCGCTAAAGAGACTTC CTCCACTGC-3'。

      利用余下的感染后的HT1080細(xì)胞,提取其總蛋白,Western印跡鑒定抑制效果。

      2 結(jié)果

      2.1 NPM1 shRNA序列設(shè)計(jì)

      根據(jù)人NPM1序列設(shè)計(jì)了4對shRNA序列(表1),經(jīng)Blast分析人基因數(shù)據(jù)庫序列,shRNA對照、shRNA2、shRNA3未發(fā)現(xiàn)同源序列,說明序列特異性好;shRNA1與CLEC2D蛋白的基因具有同源序列,但因NPM1基因序列與CLEC2D基因序列相似度達(dá)93%,姑且使用shRNA1序列。

      2.2 NPM1 shRNA干擾載體的鑒定

      經(jīng)EcoRⅠ/HpaⅠ酶切,pll3.7空載體可切下1500 bp的片段,而pll-shRNA control、pll-shRNA1、pll-shRNA2、pll-shRNA3質(zhì)粒不能切得1500 bp的片段(圖2),表明后4個(gè)載體中已插入外源片段。測序結(jié)果表明,插入的外源片段序列正確(序列略)。

      2.3 pll-shRNA對NPM1蛋白表達(dá)的沉默效果

      Western印跡結(jié)果經(jīng)PS5軟件分析,設(shè)計(jì)的3條shRNA對NPM都有不同程度的抑制效果,抑制效果分別為20%、78%、36%,即pll-shRNA2的抑制效果最好,抑制率達(dá)78%,提示pll-shRNA2具有較好的沉默NPM1基因的效果(圖3)。

      2.4 利用HT1080細(xì)胞驗(yàn)證pll-shRNA2的抑制效果

      經(jīng)過多次感染病毒,pll-shRNA2慢病毒感染效率達(dá)90%以上(圖4)。RT-PCR和Western印跡結(jié)果表明,感染pll-shRNA2病毒的HT1080細(xì)胞中幾乎沒有NPM1的mRNA和NPM蛋白的存在(圖5),在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都表明構(gòu)建的載體具有很好的抑制效果。

      圖2 質(zhì)粒EcoRⅠ/HpaⅠ雙酶切鑒定的瓊脂糖電泳

      圖3 pll-shRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后NPM1蛋白的表達(dá)

      圖4 pll-shRNA2病毒對HT1080細(xì)胞的感染效率

      圖5 pll-shRNA2病毒對HT1080細(xì)胞中NPM1的抑制效果

      3 討論

      臨床常用的傳統(tǒng)的腫瘤治療方案放療和化療對人體有很大的毒副作用,而RNA干擾可以抑制特定腫瘤的特異分子,實(shí)現(xiàn)特定組織或器官的靶向治療,降低對正常組織器官的傷害,已在臨床上得到了應(yīng)用。如通過抑制前列腺癌細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)志分子PMSA的表達(dá),實(shí)現(xiàn)了對前列腺癌的治療[11];用特定的shRNA敲除患胰腺癌小鼠體內(nèi)糖原合酶3(GST-3b)基因,抑制了腫瘤生長和血管形成[12]。

      研究表明,NPM1促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、在腫瘤細(xì)胞,特別是造血干細(xì)胞系統(tǒng)腫瘤,如白血病、淋巴瘤等中過表達(dá)[10]。因此,有效抑制NPM1的表達(dá),有希望成為治療造血干細(xì)胞系統(tǒng)腫瘤的一個(gè)新方法。

      我們根據(jù)shRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)了shRNA及空對照,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,得到抑制效果最好的pllshRNA2載體,測序正確后其病毒多次感染HT1080細(xì)胞,分別在mRNA水平和蛋白水平得到了驗(yàn)證,抑制效率幾乎達(dá)100%,達(dá)到了實(shí)驗(yàn)的目的。該NPM1載體的構(gòu)建,為NPM1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究提供了有力工具,為抗腫瘤的治療提供了依據(jù)。

      利用RNA干擾技術(shù)治療疾病在一定程度上得到了肯定,但其臨床應(yīng)用還存在很大的挑戰(zhàn):如運(yùn)載RNA的載體作為一個(gè)外源物體,可能對細(xì)胞的正常生長造成一些干擾反應(yīng)[13];RNA干擾還可能造成一些非目標(biāo)基因的抑制[14];合適的shRNA載體的選擇和啟動子的選擇,對干擾效果也是至關(guān)重要的。相信隨著眾多學(xué)者的努力,RNA干擾技術(shù)最終會在治療疾病方面發(fā)揮重要作用。

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