超黃金治療期的缺血性中風(fēng)大鼠模型、治療模式及療效表述

蔣雪云 張穎潔 趙 明*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院，北京100069)

腦卒中俗稱中風(fēng)，臨床將中風(fēng)分為缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)兩種類型。缺血性中風(fēng)患者的主要癥狀包括猝然昏倒、不省人事、口角歪斜、語言不利，以及半身不遂。缺血性中風(fēng)發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。缺血性中風(fēng)、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)和癌癥在臨床上并列為威脅人類健康的三大疾病。溶栓是臨床治療缺血性中風(fēng)的唯一方案。組織纖溶酶原激活劑(tPA)是缺血性中風(fēng)唯一有效的臨床治療藥物。由于缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)早期癥狀不易鑒別，而tPA有嚴(yán)重的出血不良反應(yīng)，以及由于缺血性中風(fēng)治療受3 h黃金期限制，可用tPA施救的機(jī)會(huì)很少。創(chuàng)造無出血不良反應(yīng)的缺血性中風(fēng)治療藥物一直是新藥研究的前沿［1-5］。形成對(duì)照的是，缺血性中風(fēng)動(dòng)物模型研究甚少?；诠P者對(duì)血栓治療藥物研究的長期興趣和療效判斷的自身需求，本文研究了長時(shí)缺血性中風(fēng)大鼠模型及其治療模式和療效表述。

1 材料與方法

1.1 大鼠的選擇

首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)為，這里描述的大鼠實(shí)驗(yàn)方案符合日內(nèi)瓦動(dòng)物試驗(yàn)指南。體質(zhì)量280～305 g的清潔級(jí)健康雄性SD大鼠［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可合格證號(hào):SCXK(京)2006－0009］，購自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。文獻(xiàn)［6-10］認(rèn)為，SD大鼠和Wistar大鼠都可制造缺血性中風(fēng)模型。對(duì)比兩種大鼠，筆者發(fā)現(xiàn)價(jià)格低的SD大鼠種系純合性好，腦血管變異小，解剖和生理特點(diǎn)更接近人類，抗感染力強(qiáng)，存活時(shí)間長，腦體積適宜。將SD大鼠自體血栓與0.9%的氯化鈉注射液的懸浮液輸入大腦中動(dòng)脈，使大腦的中動(dòng)脈支配區(qū)域形成的局灶性缺血性中風(fēng)接近缺血性中風(fēng)患者的臨床病理過程，能夠模擬臨床缺血性中風(fēng)，適合于評(píng)價(jià)缺血性中風(fēng)溶栓治療的療效。

1.2 制備血栓

SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，劑量為400 mg/kg，麻醉后分離頸動(dòng)脈，取15 mL新鮮動(dòng)脈血，按每10 μL 1份置于1.5 mL的EP管里，形成的血栓先室溫放置2 h，再于冰箱中－20℃放置22 h。使用時(shí)加0.5 mL 0.9%的氯化鈉注射液，用玻璃棒搗碎，制成大小均勻的血栓塊的0.9%的氯化鈉注射液懸浮液，通過顯微鏡觀察到每個(gè)血栓塊的體積大約為0.1 mm3。

1.3 缺血性中風(fēng)大鼠模型制備及治療方案

雄性SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，劑量為400 mg/kg，麻醉后于頸部正中縱行切口，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈主干(約3 cm長)。于舌骨水平分離結(jié)扎頸外動(dòng)脈各分支，于頸膨大處分離出頸內(nèi)動(dòng)脈。用無創(chuàng)動(dòng)脈夾分別夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈開口處和頸總動(dòng)脈近心端，并結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端。于頸外動(dòng)脈主干處插入導(dǎo)管(導(dǎo)管內(nèi)裝有0.5 mL血栓塊的0.9%的氯化鈉注射液懸浮液)，在松開頸內(nèi)動(dòng)脈夾的同時(shí)將導(dǎo)管內(nèi)的血栓塊懸浮液緩慢從頸外動(dòng)脈向近心端經(jīng)過頸內(nèi)動(dòng)脈注入大腦中動(dòng)脈。之后，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端，打開頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈處的動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流。或分離大頸外靜脈，把0.9%的氯化鈉注射液或藥物從頸外靜脈輸入，縫合傷口，肌肉注射2萬IU青霉素預(yù)防感染，得到缺血性中風(fēng)大鼠立即1次性治療方案;或縫合傷口，肌肉注射2萬IU青霉素預(yù)防感染，4、6或24 h后把0.9%的氯化鈉注射液或陽性藥物(尿激酶和tPA)及治療藥物JXY(本實(shí)驗(yàn)室合成的小分子多肽，成分為:Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val)從尾靜脈輸入，得到缺血性中風(fēng)4、6或24 h大鼠1次性治療方案;或者縫合傷口，肌肉注射2萬IU青霉素預(yù)防感染，4、6或24 h后把0.9%的氯化鈉注射液或藥物從尾靜脈輸入，每天1次，連續(xù)7 d，得到缺血性中風(fēng)4、6或24 h大鼠連續(xù)治療方案。

1.4 缺血性中風(fēng)大鼠的行為及療效

缺血性中風(fēng)大鼠0.9%的氯化鈉注射液治療組，中風(fēng)后立即治療組，中風(fēng)4、6和24 h后治療組的大鼠蘇醒24 h后觀察其行為和療效。行為包括行走方式、右眼眼皮下垂程度、尾巴僵直程度、肌肉張力、腦袋偏斜程度、四肢支撐力和死亡數(shù)。行為改善程度，描述為可視性療效。立即接受一次性藥物治療的缺血性中風(fēng)大鼠的行為與立即接受一次性0.9%的氯化鈉注射液治療的缺血性中風(fēng)大鼠的行為比較，獲得可視性療效。連續(xù)接受藥物治療的缺血性中風(fēng)大鼠每隔24 h從尾靜脈輸注一次藥物，第2天錄像，比較自身行為，獲得可視性療效;與0.9%的氯化鈉注射液治療大鼠比較眼眶、爪、鼻尖、尾部出血狀況，獲得可視性不良反應(yīng)。解剖之后，在肺、脾、胃和腸部可發(fā)現(xiàn)明顯的出血狀況。按照1.3項(xiàng)的方法誘發(fā)的缺血性中風(fēng)大鼠的行為可描述為6種損傷程度:①蘇醒之后24 h內(nèi)死亡;②不能站立，尾巴僵直;③呈追尾狀行走，腦袋偏斜，左側(cè)前肢不能伸展，尾巴僵直;④呈追尾狀行走，左側(cè)前肢不能伸展，尾巴僵直;⑤轉(zhuǎn)圈狀行走，左側(cè)前肢不能伸展，尾巴僵直;⑥轉(zhuǎn)圈狀行走，右眼皮不能完全抬起，尾巴僵直。最終處死大鼠，取大腦，切片，測(cè)腦梗死體積。

2 結(jié)果

2.1 中風(fēng)后立即接受一次性JXY治療的缺血性中風(fēng)大鼠的行為

大鼠中風(fēng)后立即接受一次性1 μmol/kg JXY治療的療效可依據(jù)給藥24 h后的行為判斷。0.9%的氯化鈉注射液為空白對(duì)照，20 000 IU/kg尿激酶和3 mg/kg tPA為陽性對(duì)照。為了定量比較療效，將上面提到的6種損傷變換為文獻(xiàn)常用的5個(gè)分值，5分為24 h內(nèi)死亡，0分為無任何損傷癥狀，表示治愈，詳見表1。

大鼠中風(fēng)后立即接受一次性0.9%的氯化鈉注射液，20 000 IU/kg尿激酶，3 mg/kg tPA 和1 μmol/kg JXY治療24 h后的行為(均未出現(xiàn)5分)為0分(治愈)的大鼠數(shù)分別為0%、10%、40%和60%;4分的大鼠數(shù)分別為10%、10%、10%和0%。0分和4分大鼠的數(shù)量說明1 μmol/kg JXY的療效比20 000 IU/kg尿激酶和3 mg/kg tPA好。

2.2 中風(fēng)4、6、24 h后連續(xù)接受藥物治療的缺血性中風(fēng)大鼠的行為

大鼠中風(fēng)4、6、24 h后接受藥物治療24 h之后，每隔24 h給1次藥，分別連續(xù)給藥4、6、8 d。大鼠的行為通過錄像記錄，自身比較。療效可依據(jù)行為的改善來判斷。經(jīng)過藥物連續(xù)治療后不能站立和尾巴僵直的大鼠的行為損傷逐步恢復(fù)，最后可直線行走，不遺留任何運(yùn)動(dòng)障礙。大鼠體質(zhì)量逐日增加。大鼠中風(fēng)4 h后接受1 μmol/kg JXY連續(xù)治療6次的結(jié)果，詳見表2。

表1 大鼠中風(fēng)后立即接受JXY一次性治療的療效Tab.1 Efficacy of acute ischemic stroke rats immediately received one time treatment of JXY

表2 大鼠中風(fēng)4 h后1 μmol/kg JXY連續(xù)治療6次的療效Tab.2 Efficacy of six times continuous treating by 1 μmol/kg JXY in acute ischemic stroke rats 4 h after symptom onset

大鼠中風(fēng)4 h后接受6次1 μmol/kg JXY連續(xù)治療為0分(治愈)的大鼠數(shù)量從第1天的9%上升到第7天的73%，治愈率增高。

2.3 中風(fēng)4 h后連續(xù)接受尿激酶和tPA治療的缺血性中風(fēng)大鼠的行為

由于嚴(yán)重的出血不良反應(yīng)，20 000 IU/kg尿激酶和3 mg/kg tPA的連續(xù)治療只允許2次，大鼠中風(fēng)4 h后20 000 IU/kg尿激酶和3 mg/kg tPA連續(xù)治療2次的結(jié)果，詳見表3。大鼠中風(fēng)4 h后接受2次20 000 IU/kg尿激酶連續(xù)治療為0分(治愈)和1分的大鼠均為0%，5分(死亡)的大鼠為33%。連續(xù)治療未提高治愈率。

大鼠中風(fēng)4 h后接受2次3 mg/kg tPA連續(xù)治療0分(治愈)的大鼠為0%。5分(死亡)的大鼠為17%。連續(xù)治療可稍稍改善療效，詳見表3。

2.4 中風(fēng)后JXY及tPA治療的缺血性中風(fēng)大鼠的腦切片

對(duì)中風(fēng)4 h后接受1次1 μmol/kg JXY和3 mg/kg tPA治療的大鼠，取大腦，切片。灰白色表示腦梗區(qū)，紅色表示正常區(qū)(圖1)。3 mg/kg tPA治療的大鼠腦切片有明顯灰白色的腦梗區(qū)(圖1A)。1 μmol/kg JXY治療的大鼠腦切片全部是紅色正常區(qū)(圖1B)?？梢姡? μmol/kg JXY的療效明顯強(qiáng)于3 mg/kg tPA。

圖1 TTC染色的大鼠腦切片F(xiàn)ig.1 Coronal slice of rats stained with TTC

表3 大鼠中風(fēng)4 h后20 000 IU/kg尿激酶或3 mg/kg tPA連續(xù)治療2次的療效Tab.3 Efficacy of two times continuous treating by 20 000 IU/kg urokinase or 3 mg/kg tPA in acute ischemic stroke rats 4 h after symptom onset

2.5 藥物的出血不良反應(yīng)

接受尿激酶或tPA連續(xù)治療3 d的中風(fēng)大鼠可以看到眼眶、爪、鼻尖、尾部出血。在肺、脾、胃和腸部可看到明顯的出血狀況。大鼠無出血不良反應(yīng)(圖2)。tPA連續(xù)治療3d，大鼠眼眶、爪、鼻和尾部都看到出血(圖3)。tPA連續(xù)治療3 d出血致死大鼠的肺、脾、胃和腸部可看到明顯出血狀況(圖4)。

圖2 無出血不良反應(yīng)的大鼠Fig.2 Rats without bleeding side effects

圖3 tPA連續(xù)治療3d眼眶、爪、鼻和尾部都看到出血的大鼠Fig.3 Bleeding occurs in eyes，paw，nose and tail in rats treated with tPA for 3 consecutive days tPA:tissue plasminogenactivator.

圖4 tPA連續(xù)治療3d出血致死大鼠的肺、脾、胃和腸部可看到明顯出血狀況Fig.4 Significant bleeding occurs in lung，spleen，stomach and enteron in dead rats treated with tPA for 3 consecutive days tPA:tissue plasminogenactivator.

3 討論

突破6 h黃金治療時(shí)間(即中風(fēng)6 h后療效確切)和避免出血不良反應(yīng)是缺血性中風(fēng)臨床治療藥物研究的2個(gè)瓶頸。建立缺血性中風(fēng)時(shí)間長的大鼠模型，是突破第1個(gè)瓶頸的基礎(chǔ)條件。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用化是突破第2個(gè)瓶頸的基礎(chǔ)條件。文獻(xiàn)［11-13］報(bào)道的大鼠模型缺血性中風(fēng)時(shí)間最長為60 min和75 min，本研究的大鼠模型把缺血性中風(fēng)時(shí)間延長至4、6、24 h。本研究將大鼠的行為細(xì)致分類，使缺血性中風(fēng)大鼠的癥狀容易描述，療效容易比較。分析缺血性中風(fēng)大鼠的行為與病情，行為與療效，療程與療效，以及行為與不良反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性，使得藥物的安全性和有效性可合理地用行為描述。對(duì)中風(fēng)4、6、24 h的大鼠分別進(jìn)行4、6和8 d連續(xù)治療，使得藥物的安全性和有效性可合理體現(xiàn)。療效治療還發(fā)現(xiàn)，大鼠在行為損傷逐步好轉(zhuǎn)期間身體非常虛弱，無自主飲水和進(jìn)食能力，體質(zhì)量快速下降。行為損傷基本消失的大鼠因饑渴可突然死亡，例如大鼠中風(fēng)4 h后接受6次1 μmol/kg JXY連續(xù)治療的第2天就出現(xiàn)了1例死亡。針對(duì)缺血性中風(fēng)使大鼠喪失自主飲水和進(jìn)食能力，在連續(xù)治療期間采取護(hù)理措施，使得患病大鼠的體質(zhì)不干擾藥物的療效。用大鼠自身行為能力改善評(píng)價(jià)藥物療效，避免了分組打分時(shí)，組間比較給療效描述帶來的模糊性。大鼠中風(fēng)4、6或24 h后連續(xù)治療4、6和8 d，實(shí)際包含了缺血性中風(fēng)大鼠定時(shí)模型和藥物治療策略兩個(gè)要素。本研究結(jié)果顯示，JXY對(duì)中風(fēng)4、6或24 h大鼠的確切療效映射了其在臨床的應(yīng)用價(jià)值。

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