枯草芽胞桿菌孢子表面展示外源蛋白的研究

孫騰云，田 瑞，張?zhí)煜?，陳華友

(江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

表面展示系統(tǒng)是運(yùn)用微生物自身功能把外源蛋白或多肽展示在噬菌體或細(xì)胞的外表面。固定化后的蛋白或多肽片段相對于游離狀態(tài)的蛋白或多肽不僅結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，且具有蛋白純化更簡單、便于回收再利用等優(yōu)點(diǎn)。Smith GP于1985年最早運(yùn)用表面展示技術(shù)使抗原展示在纖維狀噬菌體M13外表面，把抗原蛋白基因與編碼蛋白PIII的基因III連接在一起，讓其共表達(dá)，蛋白PIII由2個結(jié)構(gòu)域通過一段接頭區(qū)域連接起來而構(gòu)成，抗原蛋白就表達(dá)在接頭區(qū)域，從而把抗原展示在噬菌體的末端表面［1］。這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，人們不僅把蛋白或多肽片段展示在噬菌體表面，而且拓展到展示在細(xì)菌、酵母、孢子表面［2-4］。若想把外源蛋白或者多肽片段錨定在生命體外表面，首先需要找到合適的載體蛋白，然后把外源蛋白跟載體蛋白連接起來，為了便于外源蛋白折疊以獲得正確的構(gòu)象，在載體蛋白和外源蛋白間常常連接一段接頭蛋白［5］。無論是把外源蛋白展示在病毒表面還是菌體或者孢子表面，共同的策略都是把外源蛋白基因與編碼菌體表面蛋白或者衣殼蛋白的基因連接起來，構(gòu)建融合基因，讓外源蛋白基因與菌體表面蛋白基因或衣殼蛋白基因共表達(dá)。由于枯草芽胞桿菌孢子表面展示技術(shù)相對于其他展示系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)，因此成為最近十幾年的研究熱點(diǎn)。

1 枯草芽胞桿菌孢子表面展示的優(yōu)點(diǎn)

枯草芽胞桿菌是益生菌，已用做食品、動物飼料和水產(chǎn)養(yǎng)殖添加菌［6］。枯草芽胞桿菌目前研究較為詳盡，常被用來作為外源基因表達(dá)的宿主。王關(guān)林等合成了人efg因子，克隆到pUS168上，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌突變菌株WYBS2001，得到 hEFG 含量為 7.6 ng/mL［7］。但是枯草芽胞桿菌作為外源蛋白的表達(dá)宿主還面臨著一系列的問題，如:構(gòu)建的質(zhì)粒不太穩(wěn)定，自身分泌蛋白酶較多等。最近十幾年新興了一種利用枯草芽胞桿菌的孢子展示外源蛋白的技術(shù)。2003年Duc L H等最早把抗原多肽片段展示在枯草芽胞桿菌孢子表面［4］，相對于把蛋白或多肽片段展示在噬菌體或細(xì)菌營養(yǎng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞表面，孢子表面展示具有以下優(yōu)點(diǎn):首先，孢子具有獨(dú)特的抗逆性，可以抵抗高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、輻射等不良環(huán)境的影響而長時(shí)間存活，人們曾經(jīng)從2500～4000萬年前琥珀內(nèi)的蜜蜂腸道中發(fā)現(xiàn)一枚具有萌發(fā)為正常營養(yǎng)細(xì)胞能力的芽胞［8］;其次，當(dāng)用噬菌體或細(xì)菌營養(yǎng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞作為表面展示載體時(shí)，外源蛋白必須穿過細(xì)胞膜，這就要求外源蛋白表達(dá)后必須快速在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)折疊且具有疏水序列，從而順利通過細(xì)胞膜，而很多蛋白并不具有以上特征，但是枯草芽胞桿菌孢子的形成是內(nèi)生的，展示在孢子表面的外源蛋白并不需要穿過細(xì)胞膜;再次，枯草芽胞桿菌孢子表面有數(shù)個可以用于表面展示的孢子衣殼蛋白，這就為把多聚體蛋白展示在其表面提供了條件;最后，其胞內(nèi)有一套完整的需要消耗ATP的分子伴侶體系，在芽胞的形成過程中，不僅可以幫助自身蛋白正確折疊，還可以幫助連接在衣殼蛋白上的外源蛋白正確折疊。

2 枯草芽胞桿菌孢子的結(jié)構(gòu)

枯草芽胞桿菌孢子為近似橢圓球形的顆粒，大致可以分為3層:最內(nèi)層的核心，中層的皮質(zhì)和最外層的衣殼。芽胞核心內(nèi)主要貯存著枯草芽胞桿菌的遺傳物質(zhì)-染色體和質(zhì)粒，DNA分子并不是獨(dú)立存在的，而是與一種酸溶性的小分子蛋白(SASPs)緊密結(jié)合在一起，這些小分子蛋白占了芽胞總重的20%以上，SASPs可以保護(hù)與其緊密結(jié)合的DNA免受高溫、化學(xué)物質(zhì)和輻射的損害，對DNA具有保護(hù)作用。芽胞核心內(nèi)還儲存著正常細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的組件，如RNA、酶、核糖體，只是這些都是處在非活化狀態(tài)的，只有外界環(huán)境刺激芽胞發(fā)芽時(shí)才會活化［9-10］。核心被內(nèi)層孢子膜包裹，該膜可以阻止分子進(jìn)入孢子核心，對核心內(nèi)的遺傳物質(zhì)具有保護(hù)作用。在孢子休眠時(shí)核心處于半結(jié)晶狀態(tài)，一旦孢子在適宜的環(huán)境下發(fā)芽，就會恢復(fù)成正常的具有良好流動性的細(xì)胞膜［11-12］。

內(nèi)層孢子膜被厚厚的一層由肽聚糖組成的孢子皮質(zhì)包裹，其主要作用是保持孢子處于脫水狀態(tài)［13-15］。皮質(zhì)又被外層孢子膜包裹。

最外層是芽胞衣殼，它由超過70種芽胞衣殼蛋白經(jīng)過復(fù)雜的相互作用組成，其主要作用是防止外界有害物質(zhì)進(jìn)入芽胞內(nèi)［16］。芽胞衣殼又可分為2層:外層為顏色較深的外層芽胞衣殼，內(nèi)層為顏色較淺的內(nèi)層衣殼。2層之間有很多的芽胞衣殼蛋白CotE，負(fù)責(zé)所有外層衣殼蛋白和部分內(nèi)層衣殼蛋白的組裝。在衣殼和皮質(zhì)之間分布著芽胞衣殼蛋白SpoIVA，敲除該基因發(fā)現(xiàn)芽胞衣殼可以正常合成，但不能與皮質(zhì)結(jié)合，說明其起到連接皮質(zhì)和衣殼的作用［17］。

圖1 枯草芽胞桿菌孢子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of the spore showing the different compartments

3 枯草芽胞桿菌孢子表面展示的原理

3.1 以大腸埃希菌—枯草芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法

通過克隆的方法先把載體蛋白基因置于穿梭質(zhì)粒上，該載體蛋白基因上游含有完整的表達(dá)調(diào)控序列，再把外源蛋白基因連接在載體蛋白基因的后面，把重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽胞桿菌，然后誘導(dǎo)芽胞的形成，外源蛋白就會隨著載體蛋白的表達(dá)而共表達(dá)，最后隨載體蛋白一起展示在孢子的表面［5，18］。

3.2 基因整合的方法

該方法與基因敲除的原理相似。首先，構(gòu)建一個分別含有枯草芽胞桿菌淀粉酶基因上游部分序列和下游部分序列的大腸埃希菌質(zhì)粒，兩端序列之間還含有紅霉素抗性基因。利用克隆的方法，先把含有完整調(diào)控序列的載體蛋白基因放在2段淀粉酶基因片段之間的多克隆位點(diǎn)上，再把外源蛋白基因連接在載體蛋白基因后面，用限制性內(nèi)切酶對環(huán)狀的質(zhì)粒進(jìn)行處理，使之形成鏈狀結(jié)構(gòu)，再把該DNA片段導(dǎo)入枯草芽胞桿菌，該片段上的淀粉酶基因片段就會與基因組上的淀粉酶基因進(jìn)行同源重組，從而把連有外源蛋白基因的載體蛋白基因整合到基因組上，通過紅霉素抗性和淀粉平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。誘導(dǎo)芽胞形成時(shí)外源蛋白就會隨著載體蛋白的表達(dá)而共表達(dá)［4，19-20］。

4 枯草芽胞桿菌孢子表面展示所用載體蛋白

已報(bào)道的常用作孢子表面展示的載體蛋白有CotB、CotC和CotG。其中對CotB進(jìn)行大腸埃希菌表達(dá)，可以獲得46 ku的蛋白，但是在對孢子進(jìn)行SDS-PAGE分析時(shí)發(fā)現(xiàn)孢子中的CotB為66 ku，后經(jīng)過酵母雙雜交等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，CotB經(jīng)過了翻譯后修飾，在這個過程中存在與CotG和CotH之間的相互作用［19］。除了以上3種孢子外層衣殼蛋白，最近幾年還有一些孢子蛋白陸續(xù)地被證明可作為孢子表面展示載體蛋白。李倩等用CotX為分子載體成功地把綠色熒光蛋白(GFP)展示在孢子表面，證明CotX也可以作為孢子表面展示的分子載體。Potot S等以一種內(nèi)層孢子衣殼蛋白草酸脫羧酶(OxdD)為外源蛋白載體，在芽胞表面展示了具有活性的植酸酶和大腸埃希菌β-葡萄糖醛縮酶，這是迄今為止唯一1例證明孢子內(nèi)層衣殼蛋白也可作為蛋白載體的報(bào)道。Hinc K等［21］以CotZ為外源蛋白載體，成功地把脲酶展示在孢子表面，說明以CotZ為蛋白載體可以把大分子外源蛋白展示在孢子表面［22］。

Hinc K等為了比較CotB、CotC和CotG三種孢子衣殼蛋白展示外源蛋白的能力和方位不同，分別以3種外源蛋白為蛋白載體在孢子表面展示脲酶，當(dāng)以CotB為載體蛋白時(shí)，脲酶展示在孢子的表面，一個孢子上平均有1000個融合蛋白;當(dāng)以CotC為載體蛋白時(shí)，脲酶展示在孢子外層衣殼，一個孢子上平均有7000～15000個融合蛋白;當(dāng)以CotG為載體蛋白時(shí)，結(jié)果與CotC為載體蛋白時(shí)相似，但是有部分融合蛋白被翻譯后加工［23］。

5 枯草芽胞桿菌孢子表面展示系統(tǒng)的主要應(yīng)用

5.1 作為抗原載體應(yīng)用于制作口服疫苗

Duc，L.H等最先以CotB為載體蛋白把破傷風(fēng)毒素碳末端(TTFC)的459個氨基酸片段展示在枯草芽胞桿菌孢子表面［4］。以CotB-TTFC重組芽胞喂食小鼠或鼻腔注射后，可在小鼠血清內(nèi)檢驗(yàn)到抗TTFC IgG。Uyen NQ等［24］又分別用正在發(fā)芽的芽胞和已經(jīng)把TTFC展示在孢子表面的芽胞喂食小鼠，發(fā)現(xiàn)后者血清內(nèi)的抗體明顯高于前者，說明展示在孢子表面的抗原效果更好。李倩等以CotX蛋白載體分別把對蝦白斑病毒VP28和VP19展示在孢子表面，對蝦口服重組芽胞后也可以產(chǎn)生免疫反應(yīng)，說明以該系統(tǒng)制得的疫苗對節(jié)肢動物門的動物也有效。

5.2 作為對酶進(jìn)行固定化的載體

最近幾年有許多把酶展示在孢子表面，從而對酶進(jìn)行固定化的報(bào)道。對于一些化工酶，如何在催化反應(yīng)后進(jìn)行回收再利用成為一個難題，而把酶固定在孢子表面后，不僅可以增加酶的穩(wěn)定性，還可以通過離心回收孢子而對酶進(jìn)行回收再利用。CotG常被作為蛋白載體把有活性的酶展示在孢子表面。徐曉曼等把N-乙酰-D-神經(jīng)酰胺醛縮酶融合表達(dá)在孢子蛋白CotG的碳端，為了便于N-乙酰-D-神經(jīng)酰胺醛縮酶自由折疊而形成正確的構(gòu)象，兩段蛋白之間加上一段由2段蛋白間加上一段由5個甘氨酸和1個絲氨酸組成的接頭蛋白。經(jīng)過催化條件優(yōu)化后，用重組孢子催化N-乙酰-D-神經(jīng)酰胺，16 h 后，可以把0.2 mol/L N-乙酰-D-神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為0.16 mol/L N-乙酰-D-神經(jīng)酸。通過離心把重組孢子和反應(yīng)物分離，對孢子五次循環(huán)利用對孢子5次循環(huán)利用，發(fā)現(xiàn)其酶活損失很?。?］。Kwon S J等以CotG為蛋白載體把具有活性的大腸埃希菌β-半乳糖苷酶展示在孢子表面，大腸埃希菌β-半乳糖苷酶為大分子量的酶，每個亞基的分子量為116 ku，而且只有在四聚體的時(shí)候才具有活性。從而證明該孢子表面展示系統(tǒng)也適用于多亞基的大分子量酶［25］。Wang N等［26］證明CotC也可以用來展示具有活性的酶，家蠶乙醇脫氫酶連接在CotC碳端，獲得展示在孢子上的融合蛋白 CotC-BmADH，且具有很高的活性。

5.3 制作口服或者靶向藥物

Feng F［27］把人胰島素原融合表達(dá)在孢子蛋白CotC的碳端，2段蛋白間引入一段腸激酶位點(diǎn)(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，以重組孢子喂食家蠶，孢子上的人胰島素原在家蠶腸道內(nèi)腸激酶的作用下釋放，在家蠶血淋巴內(nèi)可以檢測到大量的人胰島素原。該實(shí)驗(yàn)為口服糖尿病藥物提供了一種方案，有待進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。Mao L等［28］以CotC把人血清白蛋白展示在孢子表面，以重組芽胞喂食小鼠，持續(xù)30 d后分析小鼠血液，發(fā)現(xiàn)其中血清白蛋白的量明顯增高，該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于臨床為人體補(bǔ)充血清白蛋白提供了一個新的策略。Nguyen V A T等［29］把鏈霉親和素與CotB一起融合表達(dá)，構(gòu)建融合孢子SA1，鏈霉親和素可以與生物?；奈魍孜魡慰?、紫杉醇結(jié)合而使其一起連接在孢子表面，西妥昔單抗可以識別結(jié)腸癌細(xì)胞HT29上的表皮生長因子受體，從而把一起結(jié)合的紫杉醇也帶向結(jié)腸癌細(xì)胞，紫杉醇可以抑制癌細(xì)胞的分裂和增值。通過在芽胞表面展示適當(dāng)?shù)纳秕；目贵w作為識別癌細(xì)胞的特異生物標(biāo)簽，重組芽胞可以普遍作為抗癌藥物的靶向運(yùn)輸載體。

5.4 為解決重金屬污染提供新思路

Hinc K等［30］在CotB的后邊連上由18個組氨酸殘基組成的多肽，獲得重組孢子，利用組氨酸殘基可以與鎳離子特異結(jié)合的特點(diǎn)對污染環(huán)境的鎳進(jìn)行吸收。重組芽胞相對野生芽胞結(jié)合鎳離子能力強(qiáng)，且該結(jié)合不易受溫度和pH的影響，通過簡單的清洗方法即可將與重組孢子結(jié)合的鎳離子洗脫下來。

表1 枯草芽胞桿菌孢子表面展示外源蛋白研究進(jìn)展Table 1 Research progress on surface display heterologous proteins on Bacillus subtilis spores

6 討論

枯草芽胞桿菌孢子表面展示技術(shù)獲得越來越多應(yīng)用的同時(shí)，還有很多新的應(yīng)用等待人們?nèi)ラ_發(fā)，許多問題等待解決?？捎糜诒砻嬲故镜逆咦右職さ鞍缀苌?，新的載體蛋白還有待去尋找;展示在孢子上的酶活性普遍較低，如何提高酶的活性成為研究的重點(diǎn)。迄今為止，尚無關(guān)于成功展示多酶復(fù)合體的報(bào)道，有待后續(xù)研究者繼續(xù)努力。

針對孢子表面展示系統(tǒng)存在的問題，本課題組進(jìn)行了一系列探索。為提高展示在孢子表面酶的活性，進(jìn)行了如下探究:①調(diào)整外源蛋白和載體蛋白之間連接的接頭蛋白的長度，找到最易于外源蛋白結(jié)合的接頭蛋白;②在孢子表面展示多酶復(fù)合體。多酶復(fù)合體是多種酶靠非共價(jià)鍵相互嵌合形成的一個大分子結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)反應(yīng)需要這些酶之間通過協(xié)同作用完成，反應(yīng)體系中前一反應(yīng)的產(chǎn)物為后一反應(yīng)的底物，反應(yīng)依次進(jìn)行，最終把底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，單是一種酶無法完成催化反應(yīng)。把組成多酶復(fù)合體的酶一起展示在孢子表面，從而形成具有類似多酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，為解決多酶復(fù)合體的表達(dá)提供了一種新的思路。實(shí)驗(yàn)策略是把一個酶的基因序列與CotC連接起來，然后整合在枯草芽胞桿菌基因組上;把另外一個酶的基因序列與CotG連接起來，通過穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽胞桿菌，誘導(dǎo)孢子形成，2種酶同時(shí)都被展示在孢子表面;③在孢子表面展示與枯草芽胞桿菌親緣關(guān)系較近的來源的酶，如來源于革蘭陽性菌的酶。

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