乙型肝炎病毒表面抗原特異性結(jié)合肽的篩選與鑒定＊

孫 鳴，馬智勇，黃朝陽(yáng)，胡 斌△，沈關(guān)心（1．廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，福建

廈門(mén) 361003；2．華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，湖北武漢 430030；3．廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門(mén) 361003）

乙型肝炎病毒（HBV）是一種嗜肝DNA病毒，是導(dǎo)致人類(lèi)急性和慢性乙型肝炎的主要原因。目前在乙型肝炎治療方面，基于RNA干擾的基因治療成為HBV感染者新的治療策略［1－5］。但是，如何將siRNA或siRNA表達(dá)盒靶向?qū)?HBV感染的肝細(xì)胞是目前應(yīng)用RNA干擾治療HBV感染的主要難題之一［6］。乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表達(dá)于HBV感染的肝細(xì)胞表面，而未感染的肝細(xì)胞不表達(dá)此抗原，是HBV基因治療的良好靶分子［4］。噬菌體展示技術(shù)是將外源的重組肽、蛋白質(zhì)包括抗體片段融合到噬菌體衣殼蛋白上的一項(xiàng)基因技術(shù)，是篩選特定分子、細(xì)胞甚至組織特異性小分子多肽的有利工具。本研究以HBsAg作為靶物質(zhì)，應(yīng)用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)篩選可以與HBsAg特異性結(jié)合的短肽序列，期望以此短肽為橋梁介導(dǎo)siRNA分子結(jié)合HBV感染的肝細(xì)胞，為乙型肝炎的靶向基因治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料來(lái)源 Ph．D．－12TM 噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)購(gòu)自 New England Biolabs公司（E8111L），庫(kù)濃度為1．0×1013pfu／mL，宿主 菌 為 E．coli2738，－96gⅢ 自 動(dòng) 測(cè) 序 引 物 （5′－CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG－3′）由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。試劑：HRP標(biāo)記的抗 M13蛋白Ⅷ單克隆抗體（＃27－9421－01，anti－M13phageⅧ，1∶5 000稀釋工作濃度）購(gòu)自 GE healthcare公司。酵母表達(dá)的HBsAg由武漢生物制品研究所饋贈(zèng)。

1．2 方法

1．2．1 噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)篩選結(jié)合HBsAg的特異性多肽 將酵母表達(dá)的 HBsAg抗原用0．1mol／L碳酸氫鈉（NaHCO3，pH 8．6）包被緩沖液稀釋成70μg／mL，每孔100μL包被96微孔板，4℃孵育過(guò)夜。倒掉包被液，每孔加滿封阻液［0．1mol／L NaHCO3，5mg／mL牛血清清蛋白（BSA），0．02%的 NaN3］，4℃封阻2h。用 TBST（50mmol／L Tris－HCl，150mmol／L NaCl，0．1%Tween－20）快速洗板6次，每孔加入1．0×1011pfu的噬菌體，室溫輕搖震蕩60min，棄去未結(jié)合的噬菌體液，用TBST洗板10次，每孔加入非特異性鹽酸甘氨酸洗脫液（0．2 mol／L Glycine－HCl，pH 2．2，1mg／mL BSA）100μL，室溫輕搖10min，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體，收集洗脫液于微量離心管，加入中和緩沖液15μL（1mol／L Tris－HCl，pH 9．1），留取5μL用于滴度測(cè)定，剩余洗脫物感染宿主菌ER2738進(jìn)行擴(kuò)增，回收后測(cè)滴度用于下一輪篩選。以上述方法進(jìn)行后面3輪篩選，使結(jié)合HBsAg的噬菌體克隆得到富集。

1．2．2 特異性結(jié)合HBsAg的噬菌體克隆測(cè)序 經(jīng)4輪篩選后，隨機(jī)挑取15個(gè)噬菌體克隆，提取DNA送公司測(cè)序。具體操作如下：將單個(gè)噬菌體克隆加入1mL ER2738培養(yǎng)物中進(jìn)行小量擴(kuò)增，取擴(kuò)增液500μL，加入200μL PEG／NaCl，混勻，室溫放置10min；10 000r／min，離心10min，棄上清液，加100 μL碘化物緩沖液（10mmol／L Tris－HCl，pH 8．0，1mmol／L EDTA，4mol／L NaI）和250μL無(wú)水乙醇懸浮沉淀，室溫溫育10min；10 000r／min，離心10min，棄上清液，用70%乙醇500 μL洗沉淀，再離心去上清液并晾干沉淀，滅菌超純水30μL懸浮即得高質(zhì)量的噬菌體克隆DNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用肽庫(kù)－96gⅢ自動(dòng)測(cè)序引物送上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

1．2．3 ELISA鑒定特異性結(jié)合HBsAg多肽的親和力 用包被緩沖液將HBsAg稀釋成20μg／mL，以每孔100μL包被微孔板，密封濕盒中4℃過(guò)夜。棄包被液，每孔加滿封阻液，4℃封阻2h。0．5%TBST洗板6次，然后按所測(cè)定的噬菌體滴度每孔加人5．0×1010pfu的噬菌體，室溫作用2h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，再加入 HRP標(biāo)記的anti－M13phageⅧ（1∶5 000）抗體，作用1h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，加入TMB顯色液和終止液。以酶標(biāo)儀讀取A450值。同時(shí)以20μg／mL BSA 100μL包被微孔板作無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照。

1．2．4 劑量依賴結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定特異性結(jié)合HBsAg多肽的特異性 將HBsAg和無(wú)關(guān)蛋白m1ECD（小鼠肝臟去唾液酸糖蛋白受體大亞基胞外段）以不同濃度（1、2．5、10、40、70μg／mL）每孔100μL包被微孔板，4℃孵育過(guò)夜，并用封阻液4℃封閉2h，0．5%TBST 洗板6次。每孔加入5．0×1010pfu的 No．3號(hào)噬菌體和原庫(kù)，室溫作用2h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，再加入 HRP標(biāo)記的anti－M13phageⅧ（1∶5 000）抗體，作用1h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，加入 TMB顯色液和終止液。以酶標(biāo)儀讀取A450值。

1．2．5 競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)鑒定特異性結(jié)合HBsAg多肽的特異性 按上述方法用20μg／mL HBsAg每孔100μL包被微孔板。將不同濃度140、70、40、20、10μg／mL 的 HBsAg取100 μL與1．0×1010pfu No．3號(hào)噬菌體上清液混勻，室溫作用2h?；靹蛭锛尤際BsAg包被微孔板內(nèi)，室溫震蕩2h，0．5%TBST洗板6次，加入HRP標(biāo)記的anti－M13phageⅧ（1∶5 000）抗體孵育1h，再用0．5%TBST洗板6次，加入TMB顯色液和終止液。以酶標(biāo)儀讀取A450值。

1．3 儀器與試劑 TMB ELISA顯色液和終止液購(gòu)自上?？迫A生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為本室配置。主要儀器：高速離心機(jī)（Beckman JA－25．50）、低溫離心機(jī)（Sigma 3－16K）、酶標(biāo)儀（Thermo multiskan MK3）等。

2 結(jié) 果

2．1 特異性結(jié)合HBsAg多肽的篩選 以酵母表達(dá)的HBsAg作為靶分子，對(duì)噬菌體十二肽庫(kù)進(jìn)行了4輪篩選，第4輪回收率（回收／投入）比第1輪增加了20倍（表1）。又進(jìn)行了輪次ELISA鑒定，用ELISA鑒定每輪洗脫物擴(kuò)增后對(duì)HBsAg親和力的增加，與HBsAg結(jié)合的噬菌體得到了有效的富集，見(jiàn)圖1。

表1 從噬菌體十二肽庫(kù)篩選HBsAg結(jié)合肽

圖1 各輪洗脫物擴(kuò)增后對(duì)HBsAg的結(jié)合

2．2 特異性結(jié)合HBsAg的噬菌體克隆測(cè)序 第4輪篩選完成后，從洗脫物測(cè)滴度平板隨機(jī)挑取15個(gè)克隆，提取噬菌體DNA并送測(cè)序。結(jié)果顯示存在9種多肽序列No．1～No．9，其中No．1～No．3為優(yōu)勢(shì)序列。見(jiàn)表2。

表2 噬菌體克隆展示肽測(cè)序結(jié)果

2．3 ELISA鑒定特異性結(jié)合HBsAg多肽的親和力 擴(kuò)增No．1～No．9噬菌體，以噬菌體ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)它們與HB－sAg的結(jié)合情況，優(yōu)勢(shì)克隆No．3與HBsAg結(jié)合最強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 No．1～No．9噬菌體的ELISA鑒定

2．4 劑量依賴結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定特異性結(jié)合HBsAg多肽的特異性 No．3號(hào)噬菌體與HBsAg的結(jié)合，隨著HBsAg包被濃度的增加而增加，而與無(wú)關(guān)蛋白m1ECD的結(jié)合沒(méi)有這種劑量依賴性。見(jiàn)圖3。

圖3 No．3號(hào)噬菌體與HBsAg的劑量依賴性結(jié)合

2．5 競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)鑒定特異性結(jié)合HBsAg多肽的特異性游離HBsAg與No．3號(hào)噬菌體預(yù)先結(jié)合后，能夠抑制噬菌體與包被HBsAg的結(jié)合，且游離HBsAg濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。此外無(wú)關(guān)蛋白m1ECD對(duì)No．3號(hào)噬菌體與包被的HB－sAg結(jié)合沒(méi)有抑制作用。見(jiàn)圖4。

圖4 游離HBsAg對(duì)No．3號(hào)噬菌體與包被HBsAg結(jié)合的抑制

3 討 論

HBV感染是全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題［7］。目前應(yīng)用于慢性乙型肝炎治療的藥物主要是干擾素和核苷酸類(lèi)似物，但干擾素因具有明顯的不良反應(yīng)限制了其長(zhǎng)期應(yīng)用，核苷酸類(lèi)似物停藥后易發(fā)生病毒DNA的反跳和肝功能異常［8］。本研究室和國(guó)內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)表明，RNA干擾（RNAi）可以有效抑制HBV的復(fù)制和基因表達(dá)，有望成為一種新的HBV感染治療策略［1－5］。但是化學(xué)合成的siRNA和質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)的shRNA缺乏肝細(xì)胞和肝臟的靶向性，限制了RNAi技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。如何將siRNA或siRNA表達(dá)盒靶向?qū)際BV感染的肝細(xì)胞，是將RNAi技術(shù)應(yīng)用于HBV感染的臨床治療研究必須予以解決的問(wèn)題之一。目前有多種方法用于細(xì)胞靶向的 RNAi，包括細(xì)胞表面特異性蛋白的單鏈抗體（scFv）［4，9］、適配子（aptamer）［10］所介導(dǎo)的siRNA導(dǎo)入，以及配體修飾的納米顆粒［11］介導(dǎo)的siRNA導(dǎo)入。它們共同點(diǎn)是找到了細(xì)胞特異性的蛋白分子，以此分子為靶標(biāo)，再通過(guò)能與靶標(biāo)分子特異結(jié)合的橋梁分子（如單鏈抗體、適配子等）介導(dǎo)siRNA導(dǎo)入。

小分子多肽具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小、穿透性好、不易引起機(jī)體免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)，可以作為一種良好的橋梁分子，而噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)為篩選具有靶向作用的橋梁分子提供了一種有效的工具［12］。本次技術(shù)方案是通過(guò)噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)篩選靶向HBV感染肝細(xì)胞的靶向性多肽。在靶分子的選擇方面剛開(kāi)始從兩個(gè)方向考慮，一是HBV表達(dá)的蛋白分子，優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，但表達(dá)豐度低；二是肝細(xì)胞表面特異性表達(dá)的分子，優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)豐度高，但特異性一般。最終選取HBsAg為靶分子，HBsAg表達(dá)于HBV感染的肝細(xì)胞表面且表達(dá)豐度較高，未感染的肝細(xì)胞不表達(dá)此抗原，是靶向HBV感染的肝細(xì)胞最特異的靶分子［13］。本研究以酵母表達(dá)的HBsAg作為靶物質(zhì)，對(duì)噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)進(jìn)行了4輪篩選，第4輪的回收率比第1輪的回收率增加20倍，輪次ELISA鑒定發(fā)現(xiàn)與HBsAg結(jié)合的噬菌體得到了有效的富集。隨機(jī)挑選了15個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行測(cè)序，并用ELISA方法檢測(cè)各個(gè)克隆對(duì)HB－sAg的親和力，結(jié)果顯示1個(gè)展示肽為SSYAPYVWQPIA的優(yōu)勢(shì)噬菌體克隆（No．3號(hào)）對(duì)HBsAg具有較強(qiáng)的親和力。隨后的HBsAg劑量依賴結(jié)合實(shí)驗(yàn)中No．3號(hào)噬菌體與HBsAg的結(jié)合隨著HBsAg包被量的增加而增加，而與無(wú)關(guān)蛋白m1ECD的結(jié)合沒(méi)有這種劑量依賴性，表明No．3號(hào)噬菌體與HBsAg的結(jié)合是特異性的。進(jìn)一步的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，先用游離HBsAg與No．3號(hào)噬菌體預(yù)先孵育后，能夠抑制噬菌體與包被HBsAg的結(jié)合，且游離的HBsAg濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，而無(wú)關(guān)蛋白m1ECD對(duì)No．3號(hào)噬菌體與包被的HBsAg結(jié)合沒(méi)有抑制作用，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證明了該噬菌體展示肽與HBsAg結(jié)合是特異性的，因此認(rèn)為十二肽SSYAPYVWQPIA可以作為橋梁分子用于乙型肝炎的基因治療。

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