瑞舒伐他汀聯(lián)合普羅布考對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化炎癥與氧化應(yīng)激的干預(yù)效果

李云攀，劉美云，趙雯娜，陳作元

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）所致的心、腦血管疾病嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康。現(xiàn)普遍認(rèn)為，AS的形成是各種損傷因素作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，并進(jìn)一步表達(dá)和釋放各種活性物質(zhì)及黏附分子共同參與的慢性炎癥過(guò)程[1-3]。同時(shí)，多種活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）所誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察大鼠動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)血清炎癥指標(biāo)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白（VE-cadherin）、脂聯(lián)素（APN）與氧化應(yīng)激指標(biāo)8-異前列腺素-F2a（8-iso-PGF2a）、超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)水平及主動(dòng)脈壁病理組織學(xué)改變，并觀察單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用降血脂藥（瑞舒伐他?。┖涂寡趸瘎ㄆ樟_布考）對(duì)以上指標(biāo)的影響，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠54只（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)檢中心提供），8周齡，體重180～220 g，飼養(yǎng)房分籠喂養(yǎng)（4～6只/籠），自由飲食。

1.1.2高脂飼料配制[5]69%基礎(chǔ)飼料、20%豬大油、5%白糖、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、1%葡萄糖酸鈣，2%蛋黃粉。

1.1.3試驗(yàn)藥品與試劑瑞舒伐他汀鈣片（10 mg/片，阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)：115449）；普羅布考（0.125 g/片，齊魯制藥有限公司，批號(hào)：2030031KL）；注射用卵清白蛋白（美國(guó)Sigma公司）；大鼠VE-vadherin酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、大鼠ADP酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、大鼠8-iso-PGF2a ELISA試劑盒、大鼠SOD ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組54只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，1周后隨機(jī)分5組，正常組（A組）12只，模型組（B組）12只，瑞舒伐他汀組（C組）10只，普羅布考組（D組）10只，瑞舒伐他汀+普羅布考組（E組）10只。

1.2.2動(dòng)物模型建立A組普通飼料喂養(yǎng)，B組及藥物干預(yù)組高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予卵清白蛋白2.5 mg/kg腹腔注射（5次/周）[6]。第8周末，A、B兩組各隨機(jī)選取2只大鼠，麻醉后處死，取主動(dòng)脈弓處血管1 cm，固定，石蠟包埋，后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察血管壁病理組織學(xué)改變，確定大鼠AS模型建立情況。第9周起，模型組及藥物干預(yù)組高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)每日進(jìn)行藥物干預(yù)，C組給予瑞舒伐他汀5 mg/kg.d灌胃，D組給予普羅布考500 mg/kg.d灌胃，E組給予瑞舒伐他汀5 mg/kg.d+普羅布考500mg/kg.d灌胃，A、B組給予生理鹽水灌胃作為對(duì)照，連續(xù)干預(yù)8周。

1.2.3血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)第16周末，全部大鼠禁食12 h, 10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉。開(kāi)胸經(jīng)右心房取血3 ml，置于普通生化管中，以3000 r/min離心，取上層血清，置于-70℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋、加樣、孵育、洗滌、加酶顯色、測(cè)定OD值等過(guò)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清VE-cadherin、8-iso-PGF2a、APN、SOD的表達(dá)。

1.2.4 HE染色第16周末，留取血清后，取主動(dòng)脈弓處血管1 cm，放于4%多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)。將固定好的血管組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯溶液組織透明、石蠟包埋后，切片。二甲苯脫蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，蒸餾水沖洗，蘇木精染色、伊紅染色，脫水透明、固定。光鏡下觀察主動(dòng)脈壁內(nèi)膜光滑度和厚度、內(nèi)膜細(xì)胞排列情況、內(nèi)膜下有無(wú)脂肪細(xì)胞和泡沫細(xì)胞聚集等，隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用Simple PCI圖像分析軟件測(cè)量主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度，取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料采用（s）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1動(dòng)物模型建立第8周末，A、B兩組大鼠，光鏡下觀察其主動(dòng)脈血管壁病理組織學(xué)改變。A組血管內(nèi)膜光滑完整且較薄，細(xì)胞排列整齊（圖1A）；B組血管內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)多發(fā)的不規(guī)則脂質(zhì)條紋，有脂肪細(xì)胞和泡沫細(xì)胞聚集（圖1B），表明動(dòng)脈粥樣硬化模型建立成功。

2.2各組大鼠血清相關(guān)指標(biāo)變化與A組比較，模型組和藥物干預(yù)組血清VE-cadherin、8-iso-PGF2a水平顯著升高（P＜0.01）；APN、SOD水平降低（P＜0.01）； 與B組比較，C、D、E組血清VE-cadherin、8-iso-PGF2a水平降低（P＜0.01），APN、SOD表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與C組比較，D、E組血清8-iso-PGF2a水平下降（P＜0.01），SOD水平升高（P＜0.01）；與C、D組比較，E組血清VE-cadherin降低（P＜0.01），APN升高（P＜0.05，表 1）。

圖1 第8周末A、B兩組大鼠主動(dòng)脈HE染色 [（200×），A：正常組；B：模型組]

2.3各組大鼠主動(dòng)脈病理組織學(xué)改變第16周末，光鏡下觀察大鼠主動(dòng)脈病理變化，A組血管內(nèi)膜光滑（圖2A），細(xì)胞排列規(guī)則。與A組比較，B組血管內(nèi)膜明顯增厚（P＜0.01，圖2B），細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)泡沫細(xì)胞和單核細(xì)胞，且細(xì)胞間隙增寬；與B組比較，C、D、E組血管壁內(nèi)膜厚度變?。≒＜0.01）（圖2C、D、E）。與C、D組比較，E組血管內(nèi)膜變?。≒＜0.05，表1）。

3 討論

圖2 16周末各組大鼠主動(dòng)脈HE染色[（400×）；A：正常組；B：模型組；C：瑞舒伐他汀組；D：普羅布考組；E：瑞舒伐他汀+普羅布考組

越來(lái)越多的研究表明，炎性反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其主要由巨噬細(xì)胞黏附于血管內(nèi)膜，于脂質(zhì)沉積在血管內(nèi)膜時(shí)，單核巨噬細(xì)胞可與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體結(jié)合吞噬脂蛋白，并轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，釋放多種炎性細(xì)胞因子，加重組織損傷[7]。

氧化應(yīng)激是體內(nèi)參與氧化和抗氧化作用相關(guān)物質(zhì)的比例失衡，從而機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基，引起細(xì)胞的毒性反應(yīng)[8,9]。氧化應(yīng)激損傷也參與了AS發(fā)病的整個(gè)過(guò)程，可通過(guò)活性氧的氧化作用誘導(dǎo)血管內(nèi)膜細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)局部炎性反應(yīng)和細(xì)胞增殖。炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激共同作用可加重對(duì)血管內(nèi)膜的損傷，加快AS的發(fā)病進(jìn)程。

VE-cadherin，又名CD144，屬于鈣粘蛋白家族成員之一，廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜表面，在血管結(jié)構(gòu)及功能的完整性、血管內(nèi)皮間的通透性以及炎性細(xì)胞在血管內(nèi)皮的表達(dá)等方面起重要作用[10]。VE-cadherin在動(dòng)脈硬化新生血管形成及斑塊不穩(wěn)定過(guò)程中扮演了重要的角色，其過(guò)度表達(dá)能夠提示AS的進(jìn)展，本研究通過(guò)檢測(cè)內(nèi)皮功能指標(biāo)VE-cadherin的含量，可間接提供有關(guān)早期AS的信息[11]。近期研究[12]結(jié)果顯示，與正常組比較，AS模型組小鼠血清VE-cadherin的表達(dá)與炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示血清VE-cadherin水平可以反映血管內(nèi)皮細(xì)胞損害程度。因此VE-cadherin成為研究AS的重要指標(biāo)。APN是近幾年新發(fā)現(xiàn)的脂肪組織特異性蛋白，研究發(fā)現(xiàn)APN在AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抵抗作用。APN可在內(nèi)皮細(xì)胞表面通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)源性一氧化氮的產(chǎn)生與釋放，抑制血管內(nèi)膜的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)作用。APN是目前被證實(shí)與代謝綜合征、糖尿病及心血管疾病呈負(fù)相關(guān)的脂肪因子，作為AS的保護(hù)性因子，可作用于AS發(fā)病機(jī)制的多個(gè)環(huán)節(jié)，也可抑制炎癥因子的表達(dá)，具有抗炎及抗AS的作用[13,14]，成為近幾年的研究熱點(diǎn)。8-iso-PGF2a是氧自由基損傷細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸，如花生四烯酸（arachidonic acid，AA）等，使其發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而形成的終末產(chǎn)物，在體液和組織中的含量極其穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確、穩(wěn)定地反映體內(nèi)脂質(zhì)氧化應(yīng)激的程度，常將其作為評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的最佳標(biāo)準(zhǔn)[15]。SOD是體內(nèi)天然存在的抗氧化因子，可抑制氧化應(yīng)激因素對(duì)血管內(nèi)膜的損傷作用，抑制和逆轉(zhuǎn)AS斑塊進(jìn)展，并可修復(fù)損傷的血管內(nèi)膜[16]。

表1 各組大鼠血清炎癥應(yīng)激指標(biāo)及主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度比較（s）

表1 各組大鼠血清炎癥應(yīng)激指標(biāo)及主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度比較（s）

注：VE-cadherin：血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白；8-iso-PGF2a：8-異前列腺素-F2a；APN：脂聯(lián)素；SOD：超氧化物歧化酶；與A組比較，aP＜0.01；與B組比較，bP＜0.01；與C組比較，cP＜0.01；與D組比較，dP＜0.05

組別 VE-cadherin（mg/L）8-iso-PGF2a（ng/L）APN（ng/ml）SOD（u/L）主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度（μm）A組（n=10）2.41±0.34 66.44±10.82 113.15±7.32 148.12±9.69 9.86±2.11 B組（n=10）5.90±1.20a 114.72±11.60a 74.12±7.74a 95.93±11.62a 33.64±6.06a C組（n=10）3.45±0.54ab 91.62±7.01ab 90.05±6.94ab 111.80±14.08ab 22.67±5.50ab D組（n=10）3.30±0.41ab 79.19±9.03abc 94.99±8.50ab 134.28±6.61abc 21.51±3.76ab E組（n=10）2.58±0.54abcd 79.66±6.65abc 104.55±4.46abcd 133.23±10.33abc 17.20±2.69abcd

在本研究中，大鼠AS VE-cadherin、8-iso-PGF2a水平明顯升高，APN、SOD水平明顯降低，表明炎癥和氧化應(yīng)激作用可能參與AS早期病變發(fā)展。實(shí)驗(yàn)中期分別給予瑞舒伐他汀、普羅布考及兩藥聯(lián)合干預(yù)后，VE-cadherin、8-iso-PGF2a水平顯著降低，APN、SOD水平顯著升高，兩藥合用可明顯降低血清VE-cadherin、8-iso-PGF2a的表達(dá)，并提高APN、SOD的表達(dá)。同時(shí)光鏡下觀察，兩藥合用主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷較單獨(dú)用藥減輕，且內(nèi)膜厚度較單用藥組薄。本研究結(jié)果表明，瑞舒伐他汀可能通過(guò)降低血清VE-cadherin含量，并升高APN的表達(dá)，來(lái)發(fā)揮其抗炎作用，達(dá)到穩(wěn)定AS斑塊、修復(fù)受損血管內(nèi)膜的作用。而普羅布考則可能通過(guò)降低血清8-iso-PGF2a含量，并升高SOD表達(dá)，來(lái)發(fā)揮其抗氧化作用。

綜上所述，瑞舒伐他汀與普羅布考均具有抗炎和抗氧化作用，普羅布考的抗氧化作用優(yōu)于瑞舒伐他汀，兩藥合用可明顯降低血清VE-cadherin水平，并升高ANP的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可指導(dǎo)兩藥在臨床中更合理的應(yīng)用。

[1]Zernecke A,Weber C. Chemokines in the vascular inflammatory response of atherosclerosis[J]. Cardiovascular Research,2010,86(2):1 92-101.

[2]蘇珂,龍艷,黃漓莉,等. 2型糖尿病高尿酸患者動(dòng)脈粥樣硬化與白細(xì)胞介素10和脂聯(lián)素的關(guān)系[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2013,21(4):331-5.

[3]談春芝,吳潔,唐朝克,等. 白細(xì)胞介素4與動(dòng)脈粥樣硬化[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2011,19(2):155-9.

[4]Seo H,Oh H,Park H,et al. Contribution of dietary intakes of antioxidants to homocysteine-induced low density lipoprotein(LDL)oxidation inatherosclerotic patients[J]. Yonsei Med J,2010,51(4):526-33.

[5]王園園,龍民慧,鄒民吉,等. 大鼠動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2008,16(6):421-3.

[6]Campbell LA,Blessing E,Rosenfeld M,et al. Mouse models of copneumoniae infection and atherosclerosis[J]. J Infect Dis,2000,181(3):508-13.

[7]Lobatto ME,Calcagno C,Metselaar JM,et al. Imaging the efficacy of anti-inflammatory liposomes in a rabbit model of atherosclerosis by non-invasive imaging [J]. Methods Enzymol,2012,508:211-28.

[8]Fujimoto H,Kobayashi H,Ohno M. Age-induced reduction in mitochondrial manganese superoxide dismutase activity and tolerance of macrophages against apoptosis induced by oxidized low density lipoprotein[J]. Circulation,2010,74(2):353-60.

[9]林春喜,林建聰,郭潤(rùn)民,等. 硫化氫通過(guò)調(diào)控JNK通路對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2013,21(1):1-5.

[10]Verin AD. Tyrosine phosphorylation and endothelial cell barrier regulation[J]. Am J Pathol, 2005,166(4):955-7.

[11]程王生,張鉦,白鋒,等. 冠心病患者中血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白的檢測(cè)及臨床意義[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2006,16(16):851-7.

[12]尹海鵬,劉向群,等. 黃芩苷對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化及VE-鈣黏蛋白表達(dá)水平的影響[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,51(9):26-30.

[13]Antoniades C,Antonopoulos AS,Tousoulis D,et al. Adiponectin:from obesity to cardiovascular disease[J]. Obes Rev,2009,10(3):269-79.

[14]Persson J,Folkersen L,Ekstrand J,et al. High plasma adiponectin concentration is associated with all-cause mortality in patients with carotid atherosclerosis[J]. Atherosclerosis,2012, 225(2):491-6.

[15]Morrow JD. Quantification of isoprostanes as indices of oxidant stress and the risk of atherosclerosis in humans[J]. Arterioscler Thromb Vase Biol,2005,25(2):279-86.

[16]Teodoro BG,Natali AJ,Fernandes SAT,et al. Improvements of atherosclerosis and hepatic oxidative stress are independent of exercise intensity in LDLr-/-mice[J]. J Atheroscler Thromb,2012,19(10):904-11.