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    氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豬可食性組織中3種β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng)

    2014-10-22 12:57:26楊建文王宗楠賀利民
    色譜 2014年2期
    關(guān)鍵詞:倫特羅凍干粉豬肝

    卞 愧,林 濤,劉 敏,楊建文,王宗楠,賀利民*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理毒理研究室,廣東 廣州 510642;2.東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心,廣東 東莞 523000)

    β-興奮劑主要用于防治人、獸支氣管哮喘及痙攣[1],由于其可提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率,常被非法用作飼料添加劑。但長(zhǎng)期使用或?yàn)E用β-興奮劑會(huì)造成其在可食性動(dòng)物組織中殘留,人食用后會(huì)引起肌肉震顫、心悸和過(guò)敏等急性中毒,世界上大多數(shù)國(guó)家已禁止其作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑應(yīng)用于食品動(dòng)物生產(chǎn)[2]。建立科學(xué)、可靠的β-興奮劑殘留分析檢測(cè)方法具有重要意義。

    基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects,ME)一般指試樣中的非待測(cè)組分影響待測(cè)物濃度或質(zhì)量測(cè)定的準(zhǔn)確度、引起待測(cè)物響應(yīng)值增加或減少的現(xiàn)象[3-5]。隨著植物源基質(zhì)中農(nóng)藥殘留測(cè)定中基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象研究的深入和措施的有效實(shí)施[6-8],動(dòng)物源基質(zhì)中獸藥殘留測(cè)定中的基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象已引起國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注,已有分別從樣品提?。?]、液液萃?。?0]和固相萃取凈化[11]、同位素標(biāo)記[12,13]及去除基質(zhì)中的磷脂[14]等方面進(jìn)行的考察,在減少和補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的措施方法上都取得了較大的進(jìn)展,但這些研究大都是探討液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象,涉及β-興奮劑殘留測(cè)定中的基質(zhì)效應(yīng)研究相對(duì)較少[15-17]。為此,本研究在已有 β-興奮劑殘留分析檢測(cè)方法基礎(chǔ)上[18],探討氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豬肝和肌肉組織中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺等β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng),研究不同狀態(tài)(新鮮與凍干粉)及不同重量的豬組織試樣產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)差異,為有效消除或補(bǔ)償β-興奮劑殘留測(cè)定中的基質(zhì)效應(yīng)提供理論依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    GCMS-QP2010(日本島津公司);IKA高速組織勻漿機(jī)(德國(guó) IKA公司);凍干機(jī)(德國(guó)Christ公司);純水機(jī)(德國(guó)Millipore公司)。

    萊克多巴胺對(duì)照品(含量≥98.5%)、克倫特羅對(duì)照品(含量≥98.5%)、沙丁胺醇對(duì)照品(含量≥98.5%)均購(gòu)自德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司;N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(99+1,v/v)(Sylon BFT)衍生劑(美國(guó) Sigma-Aldrich公司);甲苯(色譜純)(美國(guó)Fisher公司);乙腈等其他試劑均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。

    β-興奮劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 mg/L):分別準(zhǔn)確稱(chēng)取克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺對(duì)照品10 mg,用甲醇溶解,定容至100 mL,-20℃避光保存。

    β-興奮劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇稀釋配制成3種 β-興奮劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    1.2 樣品處理

    1.2.1 豬組織凍干粉的制備

    分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1、2、4、5及10 g豬肉和豬肝組織勻漿于西林瓶中(西林瓶先恒重,稱(chēng)量),于-80℃冰箱冷凍12 h,轉(zhuǎn)到冷凍干燥機(jī)上于-80℃真空冷凍24 h,再次稱(chēng)重后待提取。

    1.2.2 豬組織鮮樣和凍干粉的前處理

    西林瓶中的豬組織凍干粉用15 mL乙腈和1 mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳酸鈉溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,渦旋,超聲5 min,振蕩20 min,于4℃下以8000 r/min離心10 min。分取1 mL上清液于有塞玻璃試管中,50℃水浴氮?dú)獯蹈?。同時(shí),稱(chēng)取與凍干組織相應(yīng)重量的各鮮樣同步處理。

    將吹干的樣品試管置于80℃烘箱中干燥5 min,取出分別加入100 μL 甲苯和100 μL BFT 衍生劑,渦旋混合30 s,放入烘箱衍生1 h;取出冷卻后用甲苯定容至500 μL,渦旋混合,上機(jī)檢測(cè)。

    1.3 色譜-質(zhì)譜條件

    1.3.1 色譜條件

    色譜柱:毛細(xì)管柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:250℃;爐溫程序:初始溫度70℃,保持1 min,然后以35℃/min升至220℃,保持1 min,以35℃/min升至280℃,再以10℃/min升至290℃,保持4 min;載氣:高純氦氣;柱流速0.8 mL/min,不分流進(jìn)樣。

    1.3.2 質(zhì)譜條件

    電子轟擊離子(EI)源:源溫230℃;電子能量:70 eV;接口溫度:290℃。選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)方式,克倫特羅特征離子:m/z 86(定量離子)、212、262、277;沙丁胺醇特征離子:m/z 86、350、369(定量離子)、440;萊克多巴胺特征離子:m/z 179、234、250(定量離子)、502。

    1.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法

    按照Matuszewski等[12]提出的提取后添加法定量評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)度。分別測(cè)定空白提取液與純?nèi)軇┲刑砑油瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強(qiáng)度,計(jì)算二者的相對(duì)比值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)分析

    所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行多因素方差分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 儀器條件優(yōu)化

    參考農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-3-2008標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)[19]優(yōu)化儀器條件,實(shí)驗(yàn)表明,使用 HP-5MS毛細(xì)管色譜柱在優(yōu)化的色譜條件下目標(biāo)分析物具有良好的色譜行為,可與雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效分離。采用全掃描模式獲得3種β-興奮劑藥物的三甲基硅醚衍生物的質(zhì)譜圖如圖1所示,據(jù)此選擇每種分析物靈敏度相對(duì)較高和穩(wěn)定的4個(gè)碎片離子進(jìn)行定性、定量分析。

    圖1 3種分析物的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of the three β-agonist drugs

    2.2 豬組織凍干粉的相對(duì)重量

    根據(jù)不同稱(chēng)樣量時(shí)豬組織試樣凍干前后的重量計(jì)算豬肝臟和肌肉凍干粉占相應(yīng)鮮肝臟和肌肉的相對(duì)重量分別為30.8%~35.0%和28.2%~30.0%,如圖2所示。

    2.3 鮮豬肝臟與其凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)比較

    圖2 豬肝臟和肌肉凍干粉占相應(yīng)鮮組織的相對(duì)重量(n=3)Fig.2 Relative weight of freeze-dried pig liver and muscle to their corresponding fresh samples(n=3)

    采用1.2節(jié)前處理方法和1.3節(jié)儀器條件檢測(cè),3種β-興奮劑呈現(xiàn)顯著的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)??疾熵i肝臟基質(zhì)狀態(tài)和基質(zhì)重量2個(gè)因素對(duì)3種分析物ME的影響。SPSS多因素方差分析表明,樣品狀態(tài)(鮮樣和凍干粉)對(duì)3種分析物ME的影響差異不顯著(P>0.05);基質(zhì)重量對(duì)3種分析物響應(yīng)的影響差異均顯著(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 豬肝狀態(tài)及重量對(duì)3種分析物基質(zhì)效應(yīng)的影響Table 1 Influence of pig liver state and its weight on matrix effects of the three analytes

    進(jìn)一步分析基質(zhì)狀態(tài)(鮮豬肝及其凍干粉)對(duì)ME的影響。鮮肝臟中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為179%、317%及1076%,肝臟凍干粉中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為178%、312%及1081%,二者間各藥物的基質(zhì)效應(yīng)差異均不顯著(P>0.05)。由于在凍干的過(guò)程中,只是失去了動(dòng)物組織中的水,其他成分沒(méi)有變化,在本研究?jī)?yōu)化的前處理方法條件下,鮮樣與其相應(yīng)凍干粉的基質(zhì)提取成分類(lèi)似,所以目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)無(wú)顯著差異。

    采用GC-MS分析3種藥物存在高的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),特別是基質(zhì)中萊克多巴胺的響應(yīng)是純?nèi)軇┲械?0倍以上,使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正尤為重要。鮮豬肝及其相應(yīng)凍干粉中3種β-興奮劑的典型選擇離子色譜圖見(jiàn)圖3。

    圖3 純?nèi)軇┡c豬肝組織試樣添加3種β-興奮劑的選擇離子色譜圖Fig.3 Typical ion chromatograms of the three β-agonists in pure solvent and the spiked pig liver samples

    鮮豬肝與其凍干粉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,試樣中水分對(duì)3種β-興奮劑ME的影響較小,豬肝凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)與相應(yīng)豬肝臟新鮮組織產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)相當(dāng)。在實(shí)際樣品中β-興奮劑殘留分析測(cè)定時(shí),可以考慮用處理好的凍干粉萃取物來(lái)配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,以提高殘留分析的科學(xué)性和準(zhǔn)確性,凍干粉與鮮樣匹配重量可以參考圖2結(jié)果。同時(shí),單因素方差分析表明,1 g和2 g豬肝樣品中克倫特羅的ME與其他實(shí)驗(yàn)豬肝重量樣品間的ME差異顯著(P<0.05),沙丁胺醇的ME只有4 g與5 g樣品間的ME差異不顯著(P>0.05),其他樣品間差異顯著(P<0.05);不同豬肝重量間萊克多巴胺的ME差異均顯著(P<0.05)。這表明試樣重量對(duì)不同化合物的基質(zhì)效應(yīng)的影響是不同的。隨著試樣基質(zhì)重量增加,其干物質(zhì)的量也相應(yīng)增加,干物質(zhì)中含有的基質(zhì)效應(yīng)物質(zhì)也隨之增加,從而導(dǎo)致ME在一定范圍內(nèi)隨重量增加而增強(qiáng);當(dāng)樣品重量增加到一定程度時(shí),可能是一定量的提取液可以提取出來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)物質(zhì)的量達(dá)最大,所以ME不再繼續(xù)增強(qiáng)。因此,在一定條件下,稱(chēng)取合適重量的樣品進(jìn)行殘留分析也是值得考慮的。不同重量豬肝中3種β-興奮劑的ME大小見(jiàn)圖4。

    圖4 樣品重量對(duì)豬肝臟與肌肉組織中3種β-興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)影響(n=3)Fig.4 Influence of sample weight on matrix effects of the three β-agonists in pig liver and muscle tissues(n=3)

    2.4 鮮豬肉與其凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)比較

    多因素方差分析表明,豬肉基質(zhì)狀態(tài)和基質(zhì)重量對(duì)3種分析物ME的影響與豬肝中類(lèi)似,豬肉樣品狀態(tài)(鮮樣和凍干粉)對(duì)3種分析物的ME的影響差異不顯著(P>0.05),豬肉重量對(duì)3種分析物的ME影響顯著(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 豬肉狀態(tài)及重量對(duì)3種分析物基質(zhì)效應(yīng)的影響Table 2 Influence of state of pig muscle and its weight on matrix effects of the three analytes

    依據(jù)上述ME的計(jì)算方法,鮮豬肉中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為244%、295%及918%,豬肉凍干粉中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為262%、301%及920%。單因素方差分析表明,鮮豬肉及其凍干粉中3種β-興奮劑的ME與豬肝中的分析結(jié)果類(lèi)似,二者M(jìn)E差異不顯著(P>0.05),進(jìn)一步說(shuō)明因鮮豬組織與其相應(yīng)凍干粉的基質(zhì)提取成分類(lèi)似,所以目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)無(wú)顯著差異。鮮豬肉及其相應(yīng)凍干粉中3種β-興奮劑的典型選擇離子色譜圖見(jiàn)圖5。

    進(jìn)一步比較不同重量豬肉的ME,克倫特羅的ME 為5 g>10 g>4 g>2 g>1 g,1 g樣品與4 g、5 g及10 g樣品,2 g樣品與5 g樣品的ME差異顯著(P<0.05);沙丁胺醇的ME為5 g>10 g>4 g>2 g>1 g,只有5 g與10 g樣品的 ME差異不顯著(P>0.05),其他樣品差異顯著(P<0.05);萊克多巴胺的ME為5 g>4 g>10 g>2 g>1 g,只有4 g與10 g樣品的ME差異不顯著(P>0.05),其他重量樣品的ME差異顯著(P<0.05)。單因素方差分析表明,在一定的重量范圍內(nèi)(1~5 g),與豬肝組織類(lèi)似,ME隨著樣品重量增大而增強(qiáng);但為什么當(dāng)樣品重量大于5 g時(shí),豬肉組織中3種分析物的ME均隨樣品重量增加而減小,是否是提取不完全還需深入實(shí)驗(yàn)研究。不同重量豬肉中3種β-興奮劑的ME見(jiàn)圖4。

    3 結(jié)論

    圖5 純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)與豬肉組織試樣添加3種β-興奮劑的選擇離子色譜圖Fig.5 Typical ion chromatograms of the three β-agonists in pure solvent and the spiked pig muscle samples

    本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)了GC-MS檢測(cè)模式下,不同基質(zhì)重量、不同基質(zhì)狀態(tài)(鮮樣和凍干粉)的豬肝臟和肌肉組織中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺等3種β-興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)。方差分析結(jié)果表明:不同基質(zhì)重量的基質(zhì)效應(yīng)差異顯著(P<0.05),不同基質(zhì)狀態(tài)豬肝臟和肌肉組織的鮮樣及其凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)差異不顯著(P>0.05)。豬可食性組織相應(yīng)凍干粉有望作為通用基質(zhì),用于GC-MS測(cè)定β-興奮劑殘留中基質(zhì)效應(yīng)的校正,也為動(dòng)物性食品中藥物殘留檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)研究提供理論基礎(chǔ)。

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