液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定棉花中乙烯利、噻苯隆和敵草隆藥物的殘留量

謝 文，史穎珠，侯建波，黃超群，趙 棟，潘璐璐，董鎖拽

（1.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，浙江 杭州 310016；2.浙江立德產(chǎn)品技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310016；3.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局絲類檢測(cè)中心，浙江 杭州 310012）

隨著人們生活水平的提高和消費(fèi)觀念的改變，對(duì)服裝及紡織用品的安全和健康性能要求也不斷地提高。作為紡織品的最初原材料，棉花生長(zhǎng)的不同階段均需要使用農(nóng)藥以預(yù)防病蟲害和雜草生長(zhǎng)，以提高棉花纖維的產(chǎn)量和質(zhì)量。文獻(xiàn)［1，2］研究發(fā)現(xiàn)，乙烯利、噻苯隆和敵草隆可促使棉花葉片脫落，有利于機(jī)械化采收，且棉絮上不帶有枯葉碎片，明顯提高棉花質(zhì)量。

盡管紡織品在加工生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)除去大部分農(nóng)藥，但仍有部分農(nóng)藥殘留，其與人體皮膚接觸過(guò)程中被人體吸收會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用，重者會(huì)誘發(fā)癌癥［3］；另外在紡織工業(yè)領(lǐng)域棉花中的農(nóng)藥殘留會(huì)污染水質(zhì)和土壤。因此我國(guó)早在2002年即發(fā)布GB/T 18885-2002《生態(tài)紡織品技術(shù)要求》并已更新至2009版，其中與棉花生產(chǎn)直接有關(guān)的有54種農(nóng)藥(包括殺蟲劑、除草劑、脫葉劑)，其要求在嬰幼兒用品上農(nóng)藥殘留量總和不得超過(guò)0.5 mg/kg，在成年人用品上不得超過(guò)1.0 mg/kg［4］。GB/T 22282-2008《紡織纖維中有害物質(zhì)的限量》中規(guī)定棉和其他天然纖維素種子纖維中殺蟲劑總量不得超過(guò)0.05 mg/kg，其中包括19種農(nóng)藥［5］。但是對(duì)于皮棉中農(nóng)藥殘留限量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)目前尚未發(fā)布。

已有文獻(xiàn)［6，7］報(bào)道用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定棉花中的噻苯隆，方法定量限(LOQ)為0.01～0.5 mg/kg。郭永澤等［8］和蔡德玲等［9］采用氣相色譜-氮磷檢測(cè)器(GC-NPD)測(cè)定棉籽中敵草隆的殘留量，方法的檢出限為0.05 mg/kg，回收率為80.56%～94.14%，平立鳳等［10］采用超高效液相色譜法(UPLC)測(cè)定了甘蔗和土壤中敵草隆的殘留量，方法的檢出限分別為 5 μg/kg和 10 μg/kg。吳剛等［11］采用加速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ASE-UPLC-MS/MS)測(cè)定棉花中殘留的8種脫葉劑，該方法在前處理過(guò)程中引入加速溶劑萃取，采用正離子模式進(jìn)行測(cè)定，但該方法不能同時(shí)測(cè)定乙烯利。目前未見棉花和紡織品中乙烯利殘留量檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。食品中乙烯利殘留量的檢測(cè)一般利用乙烯利在堿性水溶液中受熱能夠快速分解成乙烯的特性，孔祥虹等［12］在樣品中加入適量的濃堿液，并在70℃下恒溫加熱，采用頂空氣相色譜法測(cè)定，方法的定量限為0.01 mg/kg。隨著高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)發(fā)展的日趨成熟，該方法被越來(lái)越多地應(yīng)用于測(cè)定和確證紡織品和食品中的農(nóng)藥殘留，吳鳳琪等［13］采用HPLC-MS/MS測(cè)定水果中的乙烯利，但未同時(shí)測(cè)定噻苯隆和敵草隆，其流動(dòng)相中使用了20 mmol/L醋酸鹽緩沖溶液，該溶液易產(chǎn)生絮狀沉淀，堵塞流動(dòng)相濾頭。目前尚未見同時(shí)檢測(cè)棉花和植物性樣品中乙烯利、噻苯隆和敵草隆的LC-MS/MS的相關(guān)報(bào)道。本研究采用甲醇-水溶液振蕩提取，利用LC-MS/MS的選擇性和抗干擾能力較強(qiáng)的特點(diǎn)，建立了同時(shí)檢測(cè)棉花中乙烯利、噻苯隆和敵草隆的LC-MS/MS方法，避免了常規(guī)分析用2～3個(gè)方法分別測(cè)定上述3種農(nóng)藥，所建立的方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，完全滿足國(guó)內(nèi)外有關(guān)法規(guī)對(duì)棉花中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，可為進(jìn)口棉花農(nóng)藥殘留的監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

API 4000Q液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源和大氣壓化學(xué)源(美國(guó)AB公司)；電子天平:感量0.1 mg、0.01 g(瑞士梅特勒公司)；Legend Mach 1.6R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)熱電公司)。

甲醇、乙腈、甲酸為色譜純(美國(guó)Tedia公司)；氫氧化鈉為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水。

乙烯利(ethephon)、噻苯隆(thidiazuron)、敵草隆(diuron)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度大于99%。標(biāo)準(zhǔn)溶液:用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)品配制為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃下避光保存。根據(jù)需要用甲醇-水(6∶4，v/v，pH=8)溶液稀釋至適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

稱取均勻樣品1 g(精確至0.01 g)，置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL甲醇-水(6∶4，v/v；用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH=8)，振搖提取20 min，以6000 r/min速率離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3 儀器條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:甲醇-水(6∶4，v/v)；流速:0.4 mL/min；進(jìn)樣量:20 μL；柱溫:20℃。

電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式掃描；質(zhì)譜掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓:-4500 V；霧化氣壓力(GS1):0.289 MPa；氣簾氣壓力(CUR):0.172 MPa；輔助氣壓力(GS2):0.31 MPa；離子源溫度(TEM):525℃；碰撞氣(CAD):5；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓及碰撞氣能量見表1。

表1 乙烯利、噻苯隆和敵草隆農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和方法定量限Table 1 Mass parameters，regression equations，correlation coefficients(r)and LOQ of ethephon，thidiazuron and diuron

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取5 mg/L乙烯利、噻苯隆和敵草隆農(nóng)藥單標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動(dòng)注射的方式以10 μL/min的流速將單標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源。根據(jù)化合物的質(zhì)譜行為，確定選擇負(fù)離子掃描。分別在負(fù)離子模式下進(jìn)行乙烯利、噻苯隆和敵草隆標(biāo)準(zhǔn)溶液母離子全掃描，再對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，選擇信噪比高、峰形好、干擾小的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量。依次對(duì)電噴霧電壓、霧化氣壓力、氣簾氣壓力、輔助氣流速、離子源溫度、碰撞氣，使分子離子與特征碎片離子強(qiáng)度達(dá)到最大。本文選擇各化合物監(jiān)測(cè)的定性離子、定量離子可以滿足2002/657/EC對(duì)質(zhì)譜確證方法的要求。乙烯利、噻苯隆和敵草隆的子離子全掃描質(zhì)譜圖見圖1。

2.2 稀釋溶液和流動(dòng)相的優(yōu)化

將乙烯利、噻苯隆和敵草隆混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用甲醇、乙腈稀釋，進(jìn)行LC-MS/MS分析，譜圖顯示，相同濃度下乙烯利以乙腈為溶劑的峰形響應(yīng)低、峰寬、拖尾；因此，實(shí)驗(yàn)用不同體積比的甲醇-水配制10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示甲醇-水體積比為 4∶6、5∶5、6∶4、7∶3 時(shí)的色譜峰峰形均較好，同時(shí)流動(dòng)相為甲醇-水(6∶4，v/v)時(shí)3個(gè)待測(cè)化合物的色譜分離較好，滿足測(cè)試要求?？紤]到定容溶劑與流動(dòng)相對(duì)待測(cè)物質(zhì)的峰形、分離度和靈敏度有很大影響，故選擇甲醇-水(6∶4，v/v)作為標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋溶液。

同時(shí)考察了甲醇-水(6∶4，v/v)的pH分別為6(用磷酸調(diào)節(jié))、7、8(用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié))的條件下目標(biāo)化合物的色譜峰峰形及信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果表明pH 8的條件下目標(biāo)化合物的峰形最好、信號(hào)最強(qiáng)。故本方法選擇pH 8的甲醇-水(6∶4，v/v)作為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的定容溶劑。

2.3 樣品提取劑的優(yōu)化

圖1 乙烯利、噻苯隆和敵草隆的子離子全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full scan product ion spectra of ethephon，thidiazuron and diuron

文獻(xiàn)［2-5，7］采用丙酮、甲醇或乙腈等作為土壤和植物樣品中敵草隆、乙烯利和噻苯隆的提取溶劑?？紤]到已優(yōu)化的定容溶劑，本文分別用甲醇、丙酮、乙腈、甲醇-水(6∶4，v/v)(pH 8)為溶劑進(jìn)行了提取劑的優(yōu)化。結(jié)果顯示，用甲醇、丙酮直接提取棉花中農(nóng)藥殘留的回收率均小于50.7%；用乙腈提取棉花樣品未測(cè)定到乙烯利，噻苯隆和敵草隆的回收率也小于39.8%；用甲醇-水(6∶4，v/v)(pH 8)作為提取溶劑，3種化合物的添加回收率為75.6% ～118%。因此選擇用甲醇-水(6∶4，v/v)(pH 8)作為提取溶劑。

2.4 提取方法的選擇和提取時(shí)間的確定

采用pH 8的甲醇-水(6∶4，v/v)對(duì)陽(yáng)性棉花樣品中乙烯利、敵草隆和噻苯隆的提取效果進(jìn)行考察，比較超聲波提取儀和振蕩器的提取效果，提取時(shí)間均為20 min，結(jié)果見圖2?？梢姅巢萋『袜绫铰〕?振搖提取的結(jié)果分別為2140/2990 μg/kg和2.29/7.41 μg/kg，具有顯著差異，乙烯利對(duì)兩種提取方法無(wú)差異，因此本方法采用振搖提取。

圖2 不同提取方法對(duì)提取效率的影響Fig.2 Effect of extracted method on the extraction efficiency

用pH 8的甲醇-水(6∶4，v/v)對(duì)乙烯利、敵草隆和噻苯隆陽(yáng)性棉花樣品分別振搖提取10、20、30 min，結(jié)果見圖3，表明隨著振搖時(shí)間的延長(zhǎng)，測(cè)得棉花中乙烯利含量由20 min的5910 μg/kg降低到30 min的1100 μg/kg，敵草隆和噻苯隆在樣品中的含量也有所降低，故將振蕩提取時(shí)間定為20 min。

2.5 樣品基質(zhì)效應(yīng)

LC-MS/MS測(cè)定藥物殘留時(shí)，有時(shí)基質(zhì)對(duì)離子對(duì)具有增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。本文制備了空白棉花樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，將其與用溶劑稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，并對(duì)添加水平乙烯利、敵草隆為40 μg/kg，噻苯隆為 4 μg/kg 的樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見表2。該結(jié)果顯示樣品基質(zhì)對(duì)待測(cè)農(nóng)藥的離子對(duì)的抑制效應(yīng)很小，可忽略不計(jì)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響Fig.3 Effect of extracted time on the extraction efficiency

表2 棉花對(duì)乙烯利、敵草隆和噻苯隆農(nóng)藥離子化的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effect of cotton on the ion intensities of ethephon，diuron and thidiazuron pesticides

2.6 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率和精密度

采用甲醇-水(6∶4，v/v，pH 8)配制乙烯利、敵草隆和噻苯隆混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，乙烯利、敵草隆的質(zhì)量濃度為 0、2.0、4.0、8.0、10.0 μg/L，噻苯隆的質(zhì)量濃度為 0、0.2、0.4、0.8、1 μg/L，對(duì) 5 點(diǎn)系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，分別以3種化合物的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖，得到各化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果顯示，在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999(見表1)。儀器定量限為10倍信噪比(S/N)時(shí)的濃度，表1中的方法定量限是通過(guò)儀器定量限和方法回收率計(jì)算得到的。

在不含3種待測(cè)組分的棉花樣品中進(jìn)行農(nóng)藥的添加回收試驗(yàn)，乙烯利、敵草隆的添加水平均為40、80和 160 μg/kg，噻苯隆添加水平為 4、8和 16 μg/kg，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，由表3可見，方法的平均回收率為89.4% ～100.2%；方法的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.7% ～11.5%?？瞻讟悠分刑砑右蚁├巢萋『袜绫铰』旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC-MS/MS選擇離子流圖見圖4。

圖4 添加乙烯利、噻苯隆、敵草隆混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(乙烯利、敵草隆 40 μg/kg，噻苯隆 4 μg/kg)的空白棉花樣品的選擇性離子流圖Fig.4 Selected ion chromatograms of a blank cotton sample spiked with ethephon，thidiazuron and diuron standard solution(40 μg/kg for ethephon and diuron，4 μg/kg for thidiazuron)

表3 空白棉花中乙烯利、敵草隆和噻苯隆的添加回收率及精密度(n=6)Table 3 Recoveries and accuracies of ethephon，diuron and thidiazuron spiked in blank cotton(n=6)

3 結(jié)論

本研究建立了采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定棉花中乙烯利、噻苯隆和敵草隆的方法，乙烯利和敵草隆的 LOQ 均為40 μg/kg，噻苯隆為4 μg/kg，回收率和精密度均符合殘留分析要求，靈敏度滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)棉花中上述化合物殘留限量的要求，該方法不僅適合棉花基質(zhì)的檢測(cè)，也為食品等其他基質(zhì)中乙烯利、噻苯隆和敵草隆的殘留測(cè)定提供了參考。

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