在線凝膠滲透色譜-二維氣相色譜/質(zhì)譜法測定鯽魚樣品中的14種農(nóng)藥殘留

李淑靜，董 梅，許 泓，宓捷波，陳其勇，葛寶坤，翟自芹

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心，天津 300461；2.天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072）

與植物源性食品不同，動(dòng)物源性食品具有基質(zhì)復(fù)雜、多樣等特點(diǎn)，通常會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生干擾，需通過樣品前處理(如提取、凈化等)降低基質(zhì)效應(yīng)。目前發(fā)展了多種提取和凈化方式，如冷凍離心、液-液分離、凝膠滲透色譜(GPC)、固相萃取(SPE)和固相微萃取(SPME)。其中，GPC對(duì)于從高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)(Mr=600～1500，如多肽、脂肪)中分離低相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)(Mr＜400，如農(nóng)藥)具有非常好的效果［1］，因此GPC常用于高脂肪樣品的目標(biāo)物凈化［2］。作為一種非常有效的前處理方式，GPC根據(jù)體積排阻的原理將不同相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)進(jìn)行分離，能很好地去除樣品基質(zhì)中可能干擾目標(biāo)化合物的油脂、色素、生物堿、聚合物等高分子化合物［3］。GPC作為一種樣品凈化手段，在國內(nèi)外應(yīng)用的已經(jīng)比較普遍，尤其在富含脂肪、色素等大分子的樣品分離凈化方面，GPC具有明顯的優(yōu)勢(shì)。使用GPC可以提高儀器的利用效率、延長分析柱壽命、提高分析精確度和準(zhǔn)確度［4-6］。GPC的使用方式主要有離線和在線兩種。離線前處理方法往往耗時(shí)、成本高并且重現(xiàn)性差，而在線GPC可以降低分析時(shí)間和成本。研究表明在線GPC-GC/MS配合程序升溫氣化(PTV)進(jìn)樣模式適用于多殘留分析［7］。

食品中農(nóng)藥殘留的檢測手段主要以氣相色譜［8］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［9，10］為主。歐陽運(yùn)富等［11］利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定蔬菜、水果中的多農(nóng)藥殘留，定量限為1 ～6 μg/kg；Yang等［12］采用配備雙脈沖火焰光度檢測器的氣相色譜測定動(dòng)物源性食品中的49種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留；Wu等［13］利用加速溶劑萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法測定動(dòng)物源性食品中109種農(nóng)藥殘留，檢出限可達(dá)0.3 μg/kg。但是由于動(dòng)物源性食品具有基質(zhì)多樣和復(fù)雜的特點(diǎn)，基質(zhì)往往會(huì)對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾［7］。因此需要通過復(fù)雜的提取、凈化步驟降低基質(zhì)對(duì)檢測結(jié)果的干擾，而復(fù)雜的前處理過程要耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑，既增加了分析成本又污染了環(huán)境。目前新發(fā)展起來的二維氣相色譜(MDGC)由于峰容量和分離效率大大提高，成為應(yīng)用于多殘留分析的強(qiáng)有力分析手段。MDGC的工作原理是將兩根色譜柱串接，通過中心切割的方式，將目標(biāo)物選擇性切割進(jìn)入二維色譜柱進(jìn)行分離。MDGC已經(jīng)用于尿液中的雙酚A和雙酚 B 的檢測［14］；Castillo 等［15］采用固相微萃取-MDGC-MS測定果汁中的46種農(nóng)藥殘留。將在線GPC與MDGC/MS技術(shù)聯(lián)用可以同時(shí)借助兩項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)多類農(nóng)藥的同時(shí)分離分析，而目前國內(nèi)外并沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

基于此，本研究采用在線GPC-MDGC/MS技術(shù)測定動(dòng)物源性食品中的多類農(nóng)藥殘留。分別選取了3大農(nóng)藥類型中比較常見且典型的14種農(nóng)藥作為研究對(duì)象(14種農(nóng)藥為有機(jī)磷農(nóng)藥中的滅線磷、甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷、氯唑磷、樂果；有機(jī)氯農(nóng)藥中的δ-六六六、六氯苯、五氯硝基苯、林丹、五氯苯胺和菊酯類農(nóng)藥七氟菊酯、芐呋菊酯、甲氰菊酯、苯醚菊酯)。樣品經(jīng)凈化后直接由系統(tǒng)導(dǎo)入MDGC/MS進(jìn)行分析。經(jīng)GPC凈化后的樣品去除了對(duì)儀器和分析結(jié)果具有損害和干擾影響的物質(zhì)，如脂肪和大分子蛋白質(zhì)，為樣品分析提供了良好的內(nèi)部環(huán)境，再加上配有PTV大體積進(jìn)樣口，最大進(jìn)樣量可達(dá)20 μL，故在線GPC-MDGC/MS分析系統(tǒng)的靈敏度和穩(wěn)定性均優(yōu)于一般的GC-MS系統(tǒng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

在線GPC-MDGC/MS裝置配有電子轟擊(EI)離子源(島津QP2010 Plus)；高速均質(zhì)器(IKA T25 digital，Turrax，德國)；離心機(jī)(Sigma 3-18K，德國)；Milli-Q純水儀(Millipore公司)；0.22 μm濾膜；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(BUCHI ROTAVAPOR R-215，瑞士)；伯仲胺(PSA)粉末(100 g，Agilent Technology)。

丙酮、環(huán)己烷、乙酸乙酯(色譜純)；中性氧化鋁(100～200目)；14種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度＞95%):滅線磷、δ-六六六、甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷、六氯苯、五氯硝基苯、林丹、樂果、氯唑磷、五氯苯胺、七氟菊酯、芐呋菊酯、甲氰菊酯、苯醚菊酯；內(nèi)標(biāo)物為環(huán)氧七氯(Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取14種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物各0.01 g，置于10 mL棕色容量瓶中，用丙酮定容，配制成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。

1.3 樣品提取

稱取5 g試樣(精確至0.01 g)，放入盛有10 g無水硫酸鈉和2 g中性氧化鋁的50 mL的離心管中，加入18 mL環(huán)己烷/乙酸乙酯(1∶1，v/v)混合溶劑，均質(zhì)提取1.5 min，于3000 r/min下離心3 min。將上清液過裝有無水硫酸鈉的筒形漏斗，收集于100 mL雞心瓶中；殘?jiān)?8 mL的環(huán)己烷/乙酸乙酯(1∶1，v/v)混合溶劑重復(fù)提取1次，經(jīng)離心過濾后，合并2次提取液；將提取液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2 mL。將上述濃縮液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，用5 mL環(huán)己烷/乙酸乙酯(1∶1，v/v)混合溶劑分兩次洗滌雞心瓶并轉(zhuǎn)移至上述離心管中，氮吹至近干。用丙酮/環(huán)己烷(3∶7，v/v)定容至2 mL，加入100 mg的PSA粉末，渦旋1 min，放入離心機(jī)中在5000 r/min下離心5 min；然后放入-18℃的冰箱中冷凍2 h。冷凍后用0.22 μm濾膜將樣液過濾入樣品瓶中待凈化、檢測。

1.4 GPC分析條件

GPC色譜柱:Shim-pack VP-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:丙酮/環(huán)己烷(30∶70，v/v)；泵A和B流量:0.10 mL/min；光電二極管陣列檢測器(PDA)檢測波長:254 nm；柱溫:40℃；進(jìn)樣量:10 μL；餾分切割時(shí)間:3.70～5.70 min；具體餾分切割程序見表1。

表1 GPC餾分切割程序Table 1 Function cutting program of GPC

1.5 MDGC分析條件

一維條件 色譜柱:DB-5MS毛細(xì)管柱(15 m×0.25 mm×0.1 μm)。PTV進(jìn)樣口；不分流恒壓模式。升溫程序:90℃保持5 min，以80℃/min升溫至290℃，保持30 min。柱溫箱升溫程序:60℃保持5 min，以8℃/min升溫至90℃，保持1 min；再以20℃/min升溫至230℃；最后以15℃/min升溫至290℃，保持10 min。載氣:高純氦氣；總流量:30 mL/min；柱流量:3.23 mL/min；線速度:34.4 cm/s；定量環(huán)體積:200 μL。

二維條件 色譜柱:DB-17MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。柱溫箱升溫程序:60℃保持18 min，以10℃/min升溫至80℃，保持5 min；再以15℃/min升溫至230℃，保持3 min；最后以25℃/min升溫至290℃，保持7 min。載氣:高純氦氣；柱頭壓力:120 kPa。

一維檢測器:氫火焰離子化檢測器(FID)；溫度:300℃；H2流量:40.0 mL/min；空氣流量:400 mL/min；尾吹氣(He)流量:30.0 mL/min。

二維檢測器:質(zhì)譜檢測器，EI源，離子源溫度200℃；接口溫度:260℃；溶劑切割時(shí)間:15 min；掃描時(shí)間:16～48 min；掃描模式:選擇離子掃描(SIM)；14種農(nóng)藥的定性離子、定量離子和保留時(shí)間見表2。

表2 14種農(nóng)藥的保留時(shí)間和定量、定性離子Table 2 Retention times，quantitative ions and qualitative ions of the 14 pesticides

2 結(jié)果與討論

2.1 MDGC的工作流程

本研究的整個(gè)工作流程見圖1。首先待測樣品經(jīng)過在線GPC的凈化，之后含有待測組分的餾分進(jìn)入定量環(huán)，然后通過閥的切換進(jìn)入氣相色譜系統(tǒng)。一維色譜采用FID作為檢測器，對(duì)各組分在第一維色譜柱上的保留時(shí)間進(jìn)行監(jiān)測。根據(jù)一維保留時(shí)間通過中心切割的方式將感興趣或未分離組分送入第二維色譜柱進(jìn)行分離，最后由質(zhì)譜給出定性和定量結(jié)果。

2.2 在線GPC條件的確定

MDGC通過排空閥排出GPC洗脫時(shí)間短的大分子油脂和色素(葉綠素、葉黃素)、生物堿、聚合物等大分子化合物，將目標(biāo)化合物導(dǎo)入捕集環(huán)路，然后經(jīng)MDGC分離最后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測。如果切入的起始時(shí)間過早或者切入的結(jié)束時(shí)間過遲，油脂、色素等成分的去除效果會(huì)降低；如果切入的時(shí)間過遲或者結(jié)束的時(shí)間過早，目標(biāo)化合物就不能全部切入氣相色譜系統(tǒng)；所以必須根據(jù)實(shí)際樣品的情況來選擇最佳的切割時(shí)間。因此，根據(jù)目標(biāo)化合物中相對(duì)分子質(zhì)量最小的滅線磷(Mr=242)和相對(duì)分子質(zhì)量最大的七氟菊酯(Mr=418)在GPC柱上的保留時(shí)間，確定GPC流出液的收集時(shí)間為3.70～5.70 min。

圖1 在線GPC-MDGC/MS工作流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of on-line GPC-MDGC/MS

應(yīng)用在線GPC系統(tǒng)可在50 min內(nèi)完成從GPC提純分析到檢測的過程。溶劑消耗只有10 mL，是常規(guī)樣品前處理的幾十分之一，大大減少了有機(jī)溶劑的消耗量，不僅能降低費(fèi)用，而且有助于減少有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境的危害。

2.3 二維切割時(shí)間的確定及分離效率

一維色譜采用FID作為檢測器，由于FID針對(duì)不同目標(biāo)化合物響應(yīng)值有差別，目標(biāo)化合物的一維分離為預(yù)分離階段，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的組分離(見圖2a)。從該圖中可以看出，14種農(nóng)藥在FID上響應(yīng)值較低，且分離效果較差，但是可以將14種化合物分4次進(jìn)行切割，即:18～20 min、21.2～25.2 min、30.7 ～31.25 min、31.75 ～34 min，通過 4次切割可將目標(biāo)化合物分4次送入二維色譜進(jìn)行進(jìn)一步的分離分析。

圖2b為經(jīng)過二維分離后由質(zhì)譜檢測器獲得的色譜圖。從該圖中可以看出，在一維色譜中無法分離的組分經(jīng)過二維分離后可以得到有效的分離。因此，通過二維切割的方式可以將一維色譜未分離組分送入二維色譜進(jìn)一步分離，從而達(dá)到徹底分離的目的。

2.4 監(jiān)測離子對(duì)的選擇

配制14種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/L)，按照儀器條件進(jìn)行全掃描。根據(jù)各農(nóng)藥的全掃描質(zhì)譜圖及背景干擾情況，對(duì)定量、定性離子進(jìn)行選擇，盡量選擇質(zhì)荷比和豐度較大且基質(zhì)在被測組分保留時(shí)間干擾最小的特征離子作為定量、定性離子，結(jié)果見表2。圖2b為14種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子監(jiān)測色譜圖。

2.5 方法的線性范圍和相關(guān)系數(shù)

圖2 14種農(nóng)藥的(a)一維色譜圖和(b)二維色譜圖Fig.2 (a)First dimensional chromatogram and(b)second dimensional chromatogram of the 14 pesticides

用丙酮將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋到質(zhì)量濃度分別為0、0.025、0.125、0.25、0.75 mg/L，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為0.2 mg/L，按照優(yōu)化的分析條件進(jìn)行線性分析，每個(gè)樣品重復(fù)測定6次，取平均值。以目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)，以目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)(X)繪制工作曲線。結(jié)果表明，14種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度在0.025～0.75 mg/L范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)(r2)＞0.99(見表3)。根據(jù)10倍S/N和目標(biāo)化合物的限量要求制定方法的定量限為0.01 mg/kg。

表3 14種農(nóng)藥的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear equations and the correlation coefficients(r2)of the 14 pesticides

2.6 方法的準(zhǔn)確度和精密度

以鯽魚作為實(shí)際樣品，分別在其中添加0.01、0.05、0.1 mg/kg 3個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，內(nèi)標(biāo)物為環(huán)氧七氯。每個(gè)水平分別做6個(gè)平行樣品，加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表4。結(jié)果表明:3個(gè)加標(biāo)水平的回收率為83.0%～112.9%，RSD為3.2%～12.0%，表明方法的準(zhǔn)確度和精確度較高，滿足檢測需求。

表4 鯽魚樣品中14種農(nóng)藥在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recoveries and RSDs of the 14 pesticides spiked in crucian carp at three levels

3 結(jié)論

建立了在線GPC-MDGC/MS檢測動(dòng)物源性食品中多種農(nóng)藥殘留的方法。采用在線GPC凈化方式可以有效地去除色素、脂肪等相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)的干擾。同時(shí)在線GPC縮短了分析時(shí)間，降低了有機(jī)溶劑的消耗。二維色譜分離模式可以使一維色譜無法分離的組分通過切割的方式進(jìn)入二維色譜進(jìn)一步分離，提高了分離效率，為多殘留分析提供了可能。方法實(shí)現(xiàn)了在線GPC和二維色譜的有效結(jié)合，準(zhǔn)確度好、精密度高，具有很好的推廣性。

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