固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中4種有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物

劉 永，唐英斐，宋金鳳，胡志偉

（1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，黑龍江 哈爾濱 150001；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江工商行政管理局，黑龍江 哈爾濱 150018）

有機(jī)磷農(nóng)藥具有廣譜、高效等眾多優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前三大支柱農(nóng)藥之一，經(jīng)過幾十年的不斷發(fā)展，在品種的數(shù)量、產(chǎn)量規(guī)模等方面都位居各種農(nóng)藥首位［1］。由于有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)細(xì)菌、害蟲、雜草生長等具有有效的控制作用和提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量而被廣泛使用，但有機(jī)磷農(nóng)藥使用過多，產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)也日益突顯，致使農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)，長期攝取含有機(jī)磷農(nóng)藥及代謝產(chǎn)物的農(nóng)作物會(huì)對(duì)人的健康造成較大影響［2］。

隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和各國在食品安全研究方面的突破，除了對(duì)原藥殘留進(jìn)行檢測(cè)外，增加了對(duì)藥物殘留代謝產(chǎn)物的研究，并對(duì)其毒性較強(qiáng)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。有機(jī)磷農(nóng)藥降解產(chǎn)物往往具有較強(qiáng)毒性，如敵百蟲在一定條件下可迅速轉(zhuǎn)化成毒性更強(qiáng)的敵敵畏［3］，乙酰甲胺磷在環(huán)境中容易降解成甲胺磷［4］，甲基對(duì)硫磷等含有苯硝基類有機(jī)磷農(nóng)藥最主要的降解產(chǎn)物是對(duì)硝基酚［5］，馬拉硫磷代謝產(chǎn)物為中間體O，O-二甲基二硫代磷酸酯等［6］。我國在國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2012中對(duì)蔬菜中各種有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留限量有明確的規(guī)定，4種有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的殘留限量為0.02～8 mg/kg(對(duì)硝基酚及O，O-二甲基二硫代磷酸酯沒有規(guī)定)，美國及歐盟的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)與GB 2763-2012所規(guī)定的限量基本一致［7］。

有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法［8］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［9］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［11］及毛細(xì)管電泳法［12］等，前處理方法主要為液液萃取［8，11］、QuEChERS 技術(shù)［10，13］、固相萃?。?，14］、固相微萃?。?5］等，但方法都局限于農(nóng)藥母體的檢測(cè)，很少關(guān)注農(nóng)藥代謝產(chǎn)物的同時(shí)檢測(cè)，而部分有機(jī)磷農(nóng)藥代謝產(chǎn)物在食品中的殘留富集，對(duì)人體帶來的傷害甚至遠(yuǎn)高于有機(jī)磷農(nóng)藥本身［4］。有機(jī)磷農(nóng)藥代謝物的檢測(cè)，若局限于某一種化合物或者是幾種可能代謝物的檢測(cè)，不具有針對(duì)性，不能作為有機(jī)磷農(nóng)藥的標(biāo)記物［16，17］。農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)，對(duì)食品安全具有更重要的價(jià)值，可能是未來農(nóng)藥殘留檢測(cè)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本文以菠菜和洋蔥為研究對(duì)象，用固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測(cè)4種有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物，對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的技術(shù)儲(chǔ)備及農(nóng)藥代謝產(chǎn)物的研究具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY Ultra Performance液相色譜系統(tǒng)，并配有溶劑管理器；Waters XEVO TQ三重四極桿質(zhì)譜儀(Waters公司)；均質(zhì)機(jī)(T 25，IKA公司)；組織搗碎機(jī)(Philips公司)；固相萃取裝置(Supelco公司)等。

有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品:馬拉硫磷(malathion，純度99.5%，F(xiàn)luka公司)，O，O-二甲基二硫代磷酸酯(dimethyl dithiophosphate，純度97%，維賽諾化學(xué)技術(shù)有限公司)，甲基對(duì)硫磷(parathionmethyl，純度99.8%，Sigma公司)，對(duì)硝基酚(4-nitrophenol，純度99.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，敵百蟲(trichlorfon，純度99.5%，Sigma公司)，敵敵畏(dimethyl dichloroviny phosphate，DDVP，純度99.8%，F(xiàn)luka公司)，乙酰甲胺磷(acephate，純度99.5%，F(xiàn)luka公司)，甲胺磷(methamidophos，純度99.5%，F(xiàn)luka公司)。標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解，于4℃冰箱中保存，使用時(shí)用流動(dòng)相定容。500 mg 6 mL活性炭固相萃取柱及500 mg 6 mL弗羅里硅土固相萃取小柱均購自Supelco公司，其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 樣品前處理方法

葉菜以菠菜為試驗(yàn)樣本。提取:樣品用組織搗碎機(jī)處理后，稱取約5 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中，加入2 g MgSO4、20 mL乙酸乙酯，均質(zhì)器均質(zhì)2 min(不低于10000 r/min)，然后于4000 r/min下離心5 min，取上層清液。凈化:取10 mL上層清液過500 mg 6 mL活性炭和500 mg 6 mL弗羅里硅土串聯(lián)小柱(小柱經(jīng)5 mL乙酸乙酯活化處理)，再用10 mL乙酸乙酯洗脫小柱，合并流出液和上樣液，氮吹至近干，用1.0 mL乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液(1∶1，v/v)溶解殘?jiān)郎y(cè)定。

其他色素含量較低的蔬菜以洋蔥為試驗(yàn)樣本。提取方法與葉菜相同，凈化方法略有不同，10 mL上層清液只經(jīng)過弗羅里硅土小柱，其他操作完全相同。

1.3 液相色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH HILIC(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫:30℃。進(jìn)樣器用強(qiáng)溶劑(30%乙腈水溶液)和弱溶劑(70%乙腈水溶液)清洗。流動(dòng)相:溶劑A為乙腈，溶劑B為5 mmol/L的乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序:0～1.0 min，50%B；1.0～1.5 min，50%B～70%B；1.5～2.0 min，70%B；2.0～2.1 min，70%B～50%B；2.1～3.0 min，50%B。流速:0.25 mL/min。

1.4 質(zhì)譜條件

毛細(xì)管電壓:2.5 kV；離子源溫度:150℃；脫溶劑氣(N2)流速:650 L/h；霧簾氣(N2)流速:50 L/h；脫溶劑氣溫度:400℃；碰撞氣:氬氣。數(shù)據(jù)處理為MassLynx v 4.1系統(tǒng)。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimized mass spectrum conditions of the organophosphorus pesticides and their metabolites

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物在乙酸乙酯、乙腈、丙酮及二氯甲烷等試劑中均有較好的溶解度，考慮到二氯甲烷對(duì)環(huán)境的污染及乳化問題，丙酮更適合于糧谷等物質(zhì)中的有機(jī)磷及代謝物提取，蔬菜通常采用乙腈和乙酸乙酯作提取試劑。葉菜類蔬菜由于多數(shù)色素含量較高，而乙腈對(duì)葉綠素、葉黃素及胡蘿卜素的提取效率高，提取液顏色較深，凈化效果不好；采用乙酸乙酯進(jìn)行提取，色素含量較低，再用活性炭小柱除去殘留的色素，效果較為理想。試驗(yàn)中選擇反相C18凈化小柱，將提取液濃縮后用含5%甲醇的乙酸銨溶液溶解過柱，由于O，O-二甲基二硫代磷酸酯及對(duì)硝基酚極性較強(qiáng)，柱保留效果不好，損失較大；采用正相凈化方式，用乙酸乙酯溶解，過氧化鋁小柱，對(duì)硝基酚的吸附作用較大，造成回收率不高；使用乙酸乙酯溶解，過弗羅里硅土小柱，凈化效果最佳，因而采用弗羅里硅土的正相取凈化方式。

2.2 檢測(cè)條件的選擇

傳統(tǒng)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)一般采用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法［8，9］，但在檢測(cè) O，O-二甲基二硫代磷酸酯及敵百蟲的過程中都遇到了一些問題［16］。O，O-二甲基二硫代磷酸酯和敵百蟲都是一種遇熱易分解的物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，O，O-二甲基二硫代磷酸酯遇熱甲基化或分解成其他小分子化合物(見圖1)，但轉(zhuǎn)化效率不高，速率較慢，因而色譜峰對(duì)稱性不好，峰形不尖銳，定量誤差較大。O，O-二甲基二硫代磷酸酯的檢測(cè)多采用五氟溴芐苯(PFBBr)衍生，將羥基屏蔽以減小O，O-二甲基二硫代磷酸酯的活性，再進(jìn)行氣化檢測(cè)的方式，但是衍生效率不高，且步驟較為繁瑣，也不利于多組分的同時(shí)檢測(cè)［16］。敵百蟲由于在高溫條件下C-P鍵易發(fā)生斷裂，分子重排后生成三氯乙醛和亞磷酸二甲酯，一般采用對(duì)亞磷酸二甲酯的檢測(cè)來確定敵百蟲的含量，但是敵百蟲的定量分解與溫度條件關(guān)系密切，只有在氣相色譜進(jìn)樣口超過260℃時(shí)，定量分解才較為充分［18］。所以O(shè)，O-二甲基二硫代磷酸酯和敵百蟲的檢測(cè)條件有一定的矛盾性，采用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用直接或衍生的檢測(cè)方法，都不利于多組分的同時(shí)檢測(cè)。

圖1 O，O-二甲基二硫代磷酸酯的(a)氣相色譜圖和(b)質(zhì)譜圖Fig.1 (a)Gas chromatogram and(b)mass spectrum of dimethyl dithiophosphate

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方式進(jìn)行檢測(cè)，多數(shù)化合物效果較好，靈敏度高，且不需要衍生，但是O，O-二甲基二硫代磷酸酯和對(duì)硝基酚極性較強(qiáng)，保留弱，使用C18色譜柱不能滿足分離要求。試驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化和選擇，使用ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱進(jìn)行分離，效果較好(見圖2)。

以菠菜作為基質(zhì)，對(duì)4種有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝物采用活性炭和弗羅里硅土串聯(lián)固相萃取小柱凈化后的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察，其基質(zhì)效應(yīng)都不高于45.1%(見表2)，說明凈化效果及質(zhì)譜條件較為合理，有利于定量分析的準(zhǔn)確性。

2.3 回收率和精密度

在蔬菜(菠菜)中添加有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率測(cè)定，每個(gè)水平測(cè)定6次，其加標(biāo)回收率為76.9%～102.8%，RSD為5.92%～10.19%(見表2)，結(jié)果表明方法符合檢測(cè)要求。

表2 菠菜中有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的加標(biāo)回收率、精密度(n=6)及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Recoveries，relative standard deviations(RSDs)(n=6)and matrix effects of the organophosphorus pesticides and metabolites spiked in spinach

表3 菠菜中有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的定量限及標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)Table 3 Limits of quantification(LOQs，S/N ＞10)in spinach and correlation coefficients(r2)of standard curves for the organophosphorus pesticides and metabolites

2.4 定量限及線性關(guān)系

將8種標(biāo)準(zhǔn)品配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，定量限采用在樣品處理后的基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)品的方式獲得，以至少大于10倍信噪比時(shí)的測(cè)得濃度計(jì)；以峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明，在0.01～1.00 mg/kg范圍內(nèi)均線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(見表3)均滿足檢測(cè)要求。

2.5 應(yīng)用

試驗(yàn)采用購自哈爾濱市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的白菜、辣椒及西紅柿，每個(gè)品種均有兩個(gè)樣本，用建立的固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)西紅柿樣本中檢測(cè)到2.3 μg/kg的馬拉硫磷；一個(gè)辣椒樣本中檢測(cè)到1.2 μg/kg的對(duì)硝基酚，但由于對(duì)硝基酚也可能為環(huán)境污染物，不能說明對(duì)硝基酚一定來自甲基對(duì)硫磷的降解。其他樣本均未檢出目標(biāo)農(nóng)藥及其代謝物。

圖2 有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mg/L)的LC-MS/MS譜圖Fig.2 LC-MS/MS chromatograms of a mixed standard solution of the organophosphorus pesticides and metabolites(0.05 mg/L)

3 結(jié)論

色素含量高的蔬菜前處理采用活性炭和弗羅里硅土串聯(lián)固相萃取凈化方式，色素含量低的蔬菜用弗羅里硅土固相萃取凈化方式，結(jié)果表明色素及其他雜質(zhì)處理效果良好，經(jīng)前處理的樣品均為無色或淺黃色；液相色譜柱選擇ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱，增強(qiáng)極性化合物保留的同時(shí)，也起到了良好的凈化分離作用，絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)較低。該方法具有良好的回收率、精密度、線性范圍和定量限，符合農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的要求，適合科研或日常工作中檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝物。

［1］Zhang Q.Guangdong Chemical Industry(張強(qiáng).廣東化工)，2013，40(10):142

［2］Wang J，Zheng X Y.Science ＆ Technology Association Forum(王晶，鄭曉燕.科協(xié)論壇)，2013(4):89

［3］Jin T M，Sun X H.Journal of Inner Mongolia University for Nationalities(金天明，孫曉輝.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版)，2002，17(5):420

［4］Kong Z Q，Dong F S，Xu J，et al.Food Control，2012，23(1):149

［5］Chávez-López C，Blanco-Jarvio A，Luna-Guido M，et al.Eur J Soil Biol，2011，47:264

［6］Loewenherz C，F(xiàn)enske R A，Simcox N J，et al.Environ Health Perspect，1997，105(12):1344

［7］Lin W X.The Compilation of Residue Limits Standards for Pesticides and Veterinary Drugs in Foodstuffs in the World(林維宣.各國食品中農(nóng)藥獸藥殘留限量規(guī)定.大連:大連海事大學(xué)出版社)，2003

［8］Liu X P，Mitrevski B，Li D K，et al.Microchem J，2013，111(7):25

［9］Rodrigues F de M，Mesquita P R R，de Oliveira L S，et al.Microchem J，2011，98(1):56

［10］Chen X S，Bian Z Y，Yang F，et al.Chinese Journal of Chromatography(陳曉水，邊照陽，楊飛，等.色譜)，2013，31(11):1116

［11］Xu Z L，Deng H，Deng X F，et al.Food Chem，2012，131(4):1569

［12］Cao L W，Liang S L，Tan X F，et al.Chinese Journal of Chromatography(曹麗偉，梁絲柳，譚小芳，等.色譜)，2012，30(12):1295

［13］Wang L Z，Zhou Y，Chen Y，et al.Chinese Journal of Chromatography(王連珠，周昱，陳泳，等.色譜)，2012，30(2):146

［14］Song W，Lin S S，Sun G D，et al.Chinese Journal of Chromatography(宋偉，林姍姍，孫廣大，等.色譜)，2012，30(3):323

［15］Jiang S X，F(xiàn)eng J J.Chinese Journal of Chromatography(蔣生祥，馮娟娟.色譜)，2012，30(3):219

［16］Wu C H，Zheng L X，Zhou Z J.Fudan Univ J:Med Sci(鄔春華，鄭力行，周志俊.復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版)，2006，33(4):552

［17］Huang Y，Li Z Y，Zhao B S.Environmental Science and Management(黃雅，李政一，趙博生.環(huán)境科學(xué)與管理)，2009，34(4):20

［18］Liu Y，Yang C Z，Kang Q H，et al.Chinese Journal of Analysis Laboratory(劉永，楊長志，康慶賀，等.分析試驗(yàn)室)，2008，27(2):119