桑螵蛸抗DPPH自由基活性成分的研究

摘要 [目的]為了研究桑螵蛸成分在體外試驗中自由基DPPH清除的效果。[方法] 利用DPPH法，測定抗自由基活性。[結果] 從桑螵蛸中分離得到N-（3，4-二羥基苯基乙基）乙酰胺（1） 和 2，4-二丁基苯酚（2），化合物1和2在DPPH自由基清除試驗中表現(xiàn)出抗自由基活性（1： EC50=12.9 μmol/L和2： EC50=17.8 μmol/L）。[結論] 桑螵蛸成分有很強的抗自由基活性。

關鍵詞 桑螵蛸;DPPH;自由基

中圖分類號 S186 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11619-02

Study of the Anti-DPPH Free Radical Component from Mantidis ootheca Extracts

XU Ming-zhe

（College of Agriculture， Yanbian University， Yanji， Jilin 133000）

Abstract [Objective] To evaluate the antiradical effect of N-acetyldopamine dimmer from Mantidis ootheca in vitro. [Method] DPPH free radical scavenging assay method was used to observe the inhibitive radical. [Result] N-（3，4-dihydroxyphenethyl） acetamide （1） and 2，4-di-tert-butylphenol （2） were isolated from the methanol extract of Mantidis ootheca using silica-gel column chromateography and C-18 gel column chromatography. Compounds 1 and 2 exhibited antiradical active-ties in the DPPH scavenging assay （1： EC50=12.9 μmol/L and 2： EC50=17.8 μmol/L）. [Conclusion] The two compounds from Mantidis ootheca have strong DPPH scavenging activities.

Key words Mantidis ootheca; DPPH; Free radical

作者簡介 徐明哲（1969-），男，吉林琿春人，副教授，博士，從事農(nóng)業(yè)昆蟲學方面的研究。

收稿日期 2014-10-15

人體中耗氧生物反應所參與的各種生物酶會產(chǎn)生超氧化物自由基、 羥基自由基以及過氧化氫等各種含氧活性粒子（ROS）[1]。適量的含氧活性粒子有助于神經(jīng)信號的傳遞和生長調節(jié)[2]。然而，由于這類活性微粒具有強氧化性，在細胞內破壞各種蛋白質、類脂和DNA，改變細胞內各種氧化還原平衡和氧化各種生化反應的中間物質[3]。含氧活性粒子過量存在于人體是有害的，會產(chǎn)生癌癥、心血管疾病、過度衰老及神經(jīng)組織退化等諸多疾病[4]。補充必要的抗氧化成分來維持體內氧化還原平衡，保證ROS含量穩(wěn)定是非常必要的。近年來，許多研究表明，食用含有抗氧化成分的新鮮水果、蔬菜、茶葉可以預防或治療過量ROS引起的疾病。常見的抗氧化成分是維生素、類黃酮、花青素以及酚類衍生物[5]。來源于水果和蔬菜的維生素C、維生素E、胡蘿卜素和芳香醇類化合物等天然抗氧化物可以有效地清除氧自由基。很多研究者從各種植物的花、果實、葉、莖及根中尋找和人工合成了各種各樣的抗氧化物質來抑制自由基氧化，其中某些抗氧化效果極好的成分被開發(fā)成各種藥物[6]。自然界中存在各種各樣的昆蟲。它們的生存環(huán)境千變萬化，形態(tài)多種多樣，數(shù)目極其繁多。但是，當前對昆蟲有效成分進行的研究甚少。筆者通過抗自由基活性檢測系統(tǒng)地對各種昆蟲進行了活性檢測，發(fā)現(xiàn)桑螵蛸的乙醇溶液具有強烈的抗自由基活性。

據(jù)調查，桑螵蛸為螳螂科昆蟲大刀螂、小刀螂或巨斧螳螂的干燥卵鞘，別名又稱蜱蛸、桑蛸、致神、螳螂子、賴尿郎、螳螂蛋、流尿狗、猴兒包等[7]。在我國，其藥用歷史可追溯到漢代以前。桑螵蛸入藥，性平，味甘咸， 入肝，腎經(jīng)，具有補腎、助陽、固精、縮尿等功能，主治腎陽不足、遺精、陽萎、早泄、白濁、赤白帶下、小便頻數(shù)、遺尿等癥[8]。目前，主要用于益腎固精、縮尿、止?jié)帷⑦z精滑精、遺尿尿頻、小便白濁等?，F(xiàn)代中藥臨床研究中，將桑螵蛸作為利尿劑[9]，且已得到廣泛的應用。桑螵蛸多與別的中藥配伍，應用最廣泛的是水煎劑，用于治療小兒遺尿等癥，如補腎活血湯、固尿湯、黃耆桑螵蛸湯、桑螵蛸散、桑螵蛸散合縮泉丸等，還有應用脈沖治療儀配合桑螵蛸散治療小兒遺尿的報道[10]。但是，桑螵蛸的抗自由基活性及其成分的化合物組成從未見報道。

1 材料與方法

1.1 藥用昆蟲原料

干燥黑螵蛸是傳統(tǒng)中藥材桑螵蛸的一種，在延吉市中藥材市場選購。

1.2 提取分離試驗

取400 g桑螵蛸粉末，浸泡于2 L乙醇液中，2 d后過濾得乙醇液體，并用旋轉蒸發(fā)器蒸發(fā)至干，得提取物20.8 g。然后，用乙酸乙酯對該提取物進行二次萃取，得到乙酸乙酯提取物8.0 g。對乙酸乙酯濃縮物進行二次柱層析分離和高效液相柱層析分離，得到化合物1、2。

1.3 自由基DPPH的清除試驗

化合物對DPPH自由基的清除試驗通過采取Lu等[11]方法進行部分修正后進行的。在4個3.0 ml比色皿中，分別加入2.0 ml新制備的自由基DPPH的乙醇溶液（100 μmol/L），保持恒定室溫。在每個比色皿中，分別加入同樣保持恒定室溫的1.0 ml 100 μmol/L的化合物1、2和參照物乙醇溶液，立即開始測定，最后一個比色皿作為空白。利用紫外分光光度計，在波長517 nm處，每隔2 min測定反應液，計算得到相應化合物的吸收曲線。在測定過程，在黑暗中進行測定。自由基清除活性 （E%） 用下式計算。

E%=[（ABS控制-ABS樣品）/ ABS控制]×100

1.4 化合物的半數(shù)有效濃度（EC50）的計算

采用Sigma Plot軟件進行計算。該軟件是科學研究專用的繪圖和數(shù)據(jù)分析軟件，比Microsoft Excel 軟件豐富準確。

2 結果與分析

2.1 確定化合物1和2 的結構

化合物 1 是白色粉末狀固體。通過高分辨質譜分析（HRFAB-MS data （m/z [M + Na]+，195.0893，calcd. 195.0895 for C10H13NO3），化合物1的分子式是C10H13NO3。它的比旋光度是+13.8°（c 0.1，甲醇）。通過核磁共振圖譜分析，得到化合物1 的結構（1H，13C，COSY，HMQC，和 HMBC）?；衔?的結構是N-（3，4-二羥基苯基乙基）乙酰胺（1）?；衔?是白色粉末狀固體。質譜顯示它的分子離子[M]+在206峰處，通過高分辨質譜分析（HRFAB-MS data（m/z [M + Na]+，206.1668，calcd. 206.1671 for C14H22O），說明它的分子式是C14H22O。通過核磁共振圖譜分析，得到它的結構（1H，13C，COSY，HMQC，和 HMBC）。因此，化合物2的結構可確定為2，4-二丁基苯酚（2）。這2個化合物的化學結構見圖1。

圖1 化合物1和2 的化學結構

2.2 自由基DPPH的清除試驗

化合物對DPPH自由基的清除能力測試是通過自由基DPPH的清除反應進行的。由圖2可知，在反應開始后，溶液的自由基含量受反應物的影響，殘余DPPH數(shù)量急速下降，反應4 min后化合物1 和化合物2猝滅，導致反應液中剩余DPPH自由基分別達31%和42%，10 min以后反應液中分別剩下5%和8%的自由基。同樣濃度的參照物（Probucol）反應4 min，則剩余61%的DPPH自由基。反應12 min后化合物1和2與DPPH反應完全，而此時參照物反應液中仍存在38%的DPPH自由基，直至反應30 min后反應液中還存在24%的DPPH自由基?；衔?和2表現(xiàn)出強烈的抗自由基活性（毫摩爾級別）。

圖2 自由基DPPH的猝滅試驗中化合物1和2的活性

2.3 化合物的EC50

經(jīng)測定，化合物1、2的EC50分別是 12.9、17.8 μmol/L。它們的抗自由基活性都達到微摩爾級別。雖然相應的參照物probucol是非常典型的藥物，但它的EC50為25.5 μmol/L，要大于化合物1、2。

3 討論

市售的桑螵蛸有團螵蛸、長螵蛸、黑螵蛸3種，但分別是哪種螳螂所產(chǎn)，尚存在很大爭議，傳統(tǒng)認為，大刀螳（Tenodera sinensis Saussuer）、小刀螳[Statilia maculate （Thunberg）]、蒲翅螳螂（Mantis religiosa La）、巨斧螳螂（Hierdula patellifera Serville）所產(chǎn)[12]。但是，有研究者證明其有誤[13]。螳螂目的昆蟲種類繁多，有的種屬甚至到現(xiàn)在仍沒有分清，可以確認的是多數(shù)螳螂目昆蟲都可以生產(chǎn)桑螵蛸。

桑螵蛸[14]含蛋白質、氨基酸、磷脂類、脂肪、粗蛋白、粗纖維、鐵鈣胡蘿卜素樣色素、檸檬酸鈣結晶、糖蛋白及脂蛋白，其中蛋白質占58.5%，脂肪占11.95%，糖占1.6%，粗纖維占20.16%;此外，桑螵蛸[15]還含有Fe、Cu、Zn、Mn、I、Co、Cr、Ni等20余種微量元素及K、P、Ca、Na、Mg等常量元素，桑螵蛸的藥用功能與其化學成分是密切相關的。楊會全等[16]對3種桑螵蛸氨基酸含量進行了分析，指出3種桑螵蛸均含有18種氨基酸，其中為人體必需的8種氨基酸。黑螵蛸總的氨基酸含量最多，長螵蛸次之，團螵蛸最少。黑螵蛸酪氨酸含量為最高，在人體中酪氨酸酶可以催化酪氨酸合成L-多巴，因此在抗氧化、精神調節(jié)、增強皮膚保護功能等方面黑螵蛸具有重要作用。桑螵蛸磷脂含量豐富，有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇及溶血磷脂酰膽堿等，總含量為0.43%。李翔[17]從團螵蛸中分離得到絡氨酸、氰尿酸、尿嘧啶、對苯二酚、胡椒酸、谷甾醇、1-（3，4-二羥基）-2-乙酰氨基-乙酮、2，2-聯(lián)苯二甲酸、3-氨基哌嗪-2，5-二酮共9個化合物。巍署飔[18]從桑螵蛸中分離得到對羥基苯乙醇、對羥基苯甲醇、3-苯基-1，2丙二醇、膽甾醇等21種化合物，可惜的是都沒有測定其抗氧化性。經(jīng)結構分析，可以預測對苯二酚、1-（3，4-二羥基）-2-乙酰氨基-乙酮、對羥基苯乙醇、對羥基苯甲醇屬于酚類化合物，都具有抗氧化性。從蔬菜和水果中提取的酚類化合物被證明具有抗氧化的生物活性。該研究也證明了這一點。臨床上，癌癥產(chǎn)生于機體某些組織的氧化，酚類化合物因具有抗氧化性而常被用于抗癌劑[19]。筆者采用生物活性為導向的新型分離方法，分離得到了N- （3，4-二羥基苯基乙基）乙酰胺、2，4-二丁基苯酚2種有生物活性的化合物。這種方法保證分離得到的化合物都具有相應的生物活性，沒有生物活性的成分在分離過程中得到有效排除。這種分離方法是為分離具有某種生物活性的有效成分而采用的。

為了測量抗自由基化合物的總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAC），研究者比較了最常用的2種方法，帶有顏色的自由基化合物ABTS（2，2-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline）-6-sulfonicacid）[20]和DPPH（ 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）成為常用的自由基化合物。在食品的抗氧化能力的測定中，這2種方法都被采用，都是利用顏色的變化來測定抗氧化能力，但表現(xiàn)出不同的機理[21]。 ABTS 方法

通常被用來測定親水化合物的抗氧化能力，而 DPPH方法可以用來測定水提取物或有機溶劑提取物中的各種親水化合物和親脂化合物的抗氧化能力[22]。有研究者同樣認為，

ABTS方法是基于藍綠變化的ABTS離子，因此這個體系適用于水相反應環(huán)境，同時適用于親水化合物。 而DPPH 方法是建立在有機相中的自由基變化，適用于有機相反應環(huán)境，主要用于親脂化合物[23]。DPPH方法適用面更廣，同時擁有很多優(yōu)點，常溫下形成穩(wěn)定的自由基和簡單、容易的實驗操作條件是最大的優(yōu)點[24]。DPPH 紫色溶液在320～325、515～520 nm波長處有2個特征的吸收峰，515～520 nm 變化更明顯，常被采用于測試波長。但要注意的是，DPPH自由基溶液在517 nm波長處的吸光度變化并非隨加入的抗氧化劑量的變化呈線性關系[25]。現(xiàn)有幾個明顯的試驗研究結果已經(jīng)證明兩者不是線性關系[26-27]，因此過去很多的DPPH試驗使用線性方程進行結果分析存在較大的系統(tǒng)誤差。該試驗結果也同樣證明這一點。DPPH活性檢測試驗在恒溫、黑暗條件下進行，測定結果最佳?；衔?在前文中已經(jīng)報道過[28]。化合物1和2是典型的抗動脈硬化藥物，對低密度脂蛋白的氧化變異有優(yōu)良的抗氧化效果，研究中則表現(xiàn)出優(yōu)良的抗自由基活性。

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