唑來(lái)膦酸對(duì)破骨細(xì)胞黏附及整合素αv、β3基因表達(dá)的影響

林玨杉　董偉　徐純峰　等

[摘要] 目的 研究唑來(lái)膦酸（ZOL）對(duì)破骨細(xì)胞黏附以及整合素αv和β3基因表達(dá)的影響。方法 體外誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，通過(guò)抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及牙本質(zhì)吸收陷窩檢測(cè)以評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞生成情況。將細(xì)胞分為對(duì)照組及ZOL處理組兩組，后者用1×10-6 mol·L-1的ZOL處理2 d，用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)細(xì)胞黏附情況，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)、Western blot和免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)整合素αv、β3 mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 TRAP染色及牙本質(zhì)吸收陷窩檢測(cè)提示有多核破骨細(xì)胞生成。ZOL處理組破骨細(xì)胞黏附能力較對(duì)照組顯著降低（P<0.01）。ZOL處理組整合素αv、β3 mRNA水平分別為0.66±0.05、0.59±0.08，顯著低于對(duì)照組的1.01±0.01和1.01±0.02（P<0.01）；蛋白表達(dá)水平分別為31 934.84±112.91、18 812.79±194.13， 較對(duì)照組（52 517.81±211.72、

31 441.93±456.87）分別下降了39.19%和40.17%（P<0.01）。免疫熒光化學(xué)檢測(cè)顯示，ZOL處理使整合素αv、β3熒光強(qiáng)度（9.491±0.748、4.744±0.759）較對(duì)照組（15.159±1.143、11.418±1.095）分別降低了37.39% 和58.45%（P<0.01）。結(jié)論 ZOL可抑制破骨細(xì)胞黏附并下調(diào)整合素αv、β3表達(dá)；ZOL的上述作用可能參與對(duì)破骨細(xì)胞性骨吸收的抑制。

[關(guān)鍵詞] 唑來(lái)膦酸； 破骨細(xì)胞； 細(xì)胞黏附； 整合素αv和β3； 封閉區(qū)

[中圖分類號(hào)] Q 26 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.004

3 討論

整合素是細(xì)胞表面重要的黏附受體，是由α、β兩個(gè)亞基組成的異源二聚體，參與細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸[2]。破骨細(xì)胞表面主要表達(dá)整合素αv和β3，通過(guò)與骨橋蛋白、骨涎蛋白、玻連蛋白等骨基質(zhì)蛋白內(nèi)的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列結(jié)合，調(diào)控破骨細(xì)胞的黏附、遷移、封閉區(qū)形成及骨吸收[5]。

研究[2，6]表明，許多信號(hào)分子參與了整合素αv、β3介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控。整合素αv、β3與骨基質(zhì)蛋白中RGD序列結(jié)合，從而使細(xì)胞質(zhì)與其結(jié)合的c-Src活化，并與適配蛋白脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）形成復(fù)合體。Syk通過(guò)SH2功能域與破骨細(xì)胞表面DNAX活化蛋白12（DNAX-activating protein 12，Dap12）的免疫酪氨酸活化基序（immu-noreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）功能域結(jié)合?；罨腸-Src使Syk磷酸化，進(jìn)而激活下游信號(hào)分子SLP-76（含有SH2結(jié)構(gòu)域的相對(duì)分子質(zhì)量為7.6×104的白細(xì)胞蛋白）和鳥嘌呤轉(zhuǎn)換因子Vav3，使無(wú)活性的Rac轉(zhuǎn)變成活性Rac，從與二磷酸鳥苷（gua-nosine diphosphate，GDP）結(jié)合轉(zhuǎn)變成與三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合；從而誘發(fā)破骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架重排形成肌動(dòng)蛋白環(huán)。整合素αv、β3分布于肌動(dòng)蛋白環(huán)的內(nèi)側(cè)和外側(cè)，形成封閉區(qū)，為骨吸收提供所需的微環(huán)境。

整合素αv、β3功能改變會(huì)對(duì)破骨細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架重排及封閉區(qū)形成產(chǎn)生重要影響。整合素β3基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的骨量增加，這與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收障礙有關(guān)[7]。即使在RANKL和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factors，M-CSF）作用下，整合素β3-/-破骨細(xì)胞也不能形成肌動(dòng)蛋白環(huán)，骨吸收活性明顯下降[8]；整合素β3點(diǎn)突變會(huì)使破骨細(xì)胞遷移能力顯著降低[9]。雙膦酸鹽作為破骨細(xì)胞的有效抑制藥物，能否通過(guò)影響整合素αv、β3來(lái)發(fā)揮對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用，目前尚不清楚。在本研究中，應(yīng)用RANKL誘導(dǎo)RAW263.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，同時(shí)用1×10-6 mol·L-1 ZOL處理；發(fā)現(xiàn)ZOL處理組整合素αv、β3 mRNA水平較對(duì)照組明顯下降，蛋白水平也分別下降了39.19%和40.17%；免疫熒光檢測(cè)也表明，ZOL組整合素αv、β3熒光強(qiáng)度顯著降低，分別下降了37.39%和58.45%。上述結(jié)果提示，ZOL可顯著抑制破骨細(xì)胞中整合素αv、β3基因表達(dá)，從而影響αv、β3在破骨細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架重排及骨吸收中的作用。結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，ZOL處理組OD值顯著低于對(duì)照組，證實(shí)了ZOL對(duì)破骨細(xì)胞黏附的抑制作用。國(guó)外學(xué)者[10]應(yīng)用人成骨細(xì)胞作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)ZOL同樣可抑制細(xì)胞黏附及整合素αv、β3基因的表達(dá)。研究[11]發(fā)現(xiàn)，接受雙膦酸鹽長(zhǎng)期治療的患者體內(nèi)存在巨大的破骨細(xì)胞，不能貼附于骨組織表面，這也可能與雙膦酸鹽對(duì)破骨細(xì)胞表面整合素αv、β3的抑制有關(guān)。

研究整合素在破骨細(xì)胞功能中的作用有極其重要的價(jià)值。破骨細(xì)胞在骨質(zhì)疏松、多發(fā)性骨髓瘤、骨轉(zhuǎn)移瘤等多種病理性骨吸收中發(fā)揮著重要作用[1]；而其進(jìn)行骨吸收的前提是通過(guò)整合素αv、β3與骨基質(zhì)表面發(fā)生黏附，使細(xì)胞骨架重排，形成封閉區(qū)和皺褶緣，為骨吸收提供局部微環(huán)境[2， 5-6]。臨床前研究表明，整合素αv、β3靶向藥物，如多肽（S247、ATN-

161、cilengitide）及非肽類小分子（PSK1404），均可有效抑制骨吸收及腫瘤骨轉(zhuǎn)移[12-13]；從而為以整合素αv、β3為靶向進(jìn)行藥物干預(yù)，抑制上述病理狀態(tài)下的骨吸收開辟了新途徑。

本研究表明，在體外ZOL可有效地抑制破骨細(xì)胞整合素αv、β3的基因表達(dá)，降低細(xì)胞的黏附能力；ZOL的上述作用可能與其對(duì)破骨細(xì)胞性骨吸收的抑制有關(guān)。

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（本文采編 石冰）