毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展概論

宮紅梅

【摘要】本文綜述了高效毛細(xì)管電泳的分離原理及模式，蛋白質(zhì)的分離特性及抑制吸附的方法，電滲流的影響因素和控制方法。

【關(guān)鍵詞】高效毛細(xì)管電泳;蛋白質(zhì);電滲流

1.背景

毛細(xì)管電泳法由于其特有的快速，高效，簡(jiǎn)單，成本低等特點(diǎn)也越來(lái)越多的應(yīng)用于蛋白質(zhì)的研究中，如多肽的分析，蛋白質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)差異分析，以及鑒定蛋白質(zhì)的純度，蛋白質(zhì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量等[1]。

2.毛細(xì)管電泳在蛋白分離中的應(yīng)用

2.1 高效毛細(xì)管電泳用于蛋白質(zhì)分離的模式

（1）毛細(xì)管區(qū)帶電泳：HPCE中最簡(jiǎn)單的、應(yīng)用最廣泛的一種方式，毛細(xì)管內(nèi)只充入緩沖溶液，分離過(guò)程中電滲流由毛細(xì)管內(nèi)壁表面電荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動(dòng)起著主導(dǎo)作用。一組化合物中，陽(yáng)離子遷移最快，中性物質(zhì)居中，而陰離子速度最慢。被分析物中各化合物帶電荷數(shù)差別越大，相對(duì)分子質(zhì)量的差別越大，分離度越大，但所有的中性物質(zhì)彼此不能分離。

（2）膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC或MEKC）：結(jié)合了電泳技術(shù)與色譜技術(shù)，也是HPCE中應(yīng)用最廣的方式之一。MECC是唯一的既能分離中性組分又能分離帶電組分的電泳技術(shù)。其原理是在緩沖溶液中加入表面活性劑，如果表面活性劑的濃度達(dá)到臨界濃度，則表面活性劑單體就結(jié)合在一起形成膠束。在緩沖液中添加的表面活性劑具有吸附、增溶、形成膠束等功能，因此增加了該模式分離化合物的范圍[2]。

（3）毛細(xì)管凝膠電泳（GCE）：毛細(xì)管內(nèi)填充凝膠或其他篩分介質(zhì)，荷質(zhì)比相同但大小不同的分子，在電場(chǎng)力的推動(dòng)下經(jīng)凝膠聚合物構(gòu)成的網(wǎng)狀介質(zhì)中電泳受到的阻力不同達(dá)到分離。鑒于凝膠的一些缺點(diǎn)，最近有高分子聚合物代替凝膠，在毛細(xì)管中形成動(dòng)態(tài)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，溶質(zhì)在網(wǎng)格中發(fā)生相對(duì)移動(dòng)，從而依靠分子大小進(jìn)行分離，即無(wú)膠篩分毛細(xì)管電泳（NGSCE）。

（4）毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）：當(dāng)兩性物質(zhì)在毛細(xì)管中形成pH梯度時(shí)，不同等電點(diǎn)的物質(zhì)在外電場(chǎng)作用下向等電點(diǎn)的pH值范圍遷移，當(dāng)溶質(zhì)遷移到等于其等電點(diǎn)范圍時(shí)，就不再移動(dòng)，形成一個(gè)窄的溶質(zhì)帶，使具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)可以分離。

2.2 蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)及對(duì)分離的影響

蛋白質(zhì)是由氨基酸通過(guò)酰胺鍵連接而成的高分子，氨基酸屬兩性分子，并有堿性、中性、酸性之分。對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)也是兩性物質(zhì)，亦有堿性、中性和酸性之分。蛋白質(zhì)因其折迭方式、空間結(jié)構(gòu)和修飾基因等的不同，還有親水或疏水之分。兩性物質(zhì)所帶凈電荷為零時(shí)的pH值稱(chēng)等電點(diǎn)pI。當(dāng)所處環(huán)境大于等電點(diǎn)時(shí)，兩性物質(zhì)帶負(fù)電荷;當(dāng)所處環(huán)境小于等電點(diǎn)時(shí)，兩性物質(zhì)帶正電荷。在CZE分離蛋白質(zhì)混合物時(shí)，由于蛋白質(zhì)所帶的電荷種類(lèi)和密度不同達(dá)到分離[3]。但是，毛細(xì)管的表面硅羥基解離，帶負(fù)電荷，在分離的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大于電泳緩沖液的pH值時(shí)，會(huì)產(chǎn)生靜電吸附，除了硅醇負(fù)離子，融硅表面還會(huì)產(chǎn)生各種活性位點(diǎn)，如惰性硅氧橋和氫鍵位點(diǎn)，這些活性位點(diǎn)都會(huì)參與蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水區(qū)與管內(nèi)壁的作用，因此很容易出現(xiàn)吸附問(wèn)題，尤其是對(duì)堿性蛋白質(zhì)。此外，由于毛細(xì)管內(nèi)壁的不均一性，容易對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生物理吸附，當(dāng)分析物濃度在0.1-1.0mg/ml時(shí)，影響非常嚴(yán)重。不管是物理吸附還是化學(xué)吸附，都會(huì)導(dǎo)致峰拖尾，展寬，使分離效率下降，分離時(shí)間延長(zhǎng)，重現(xiàn)性差，甚至電滲流消失，嚴(yán)重影響分離。因此，吸附問(wèn)題是分離過(guò)程中要首要解決的[4]。

2.3 常用的解決吸附問(wèn)題的方法

（1）采用極端pH值（pH8～11或pH<2）的緩沖溶液。Righetti等在pH值2.0-2.5時(shí)，為了克服高電導(dǎo)而不能加高電壓地缺點(diǎn)，提出了一種采用等電緩沖液的辦法，實(shí)現(xiàn)了僅一個(gè)中性氨基酸不同的兩條球蛋白鏈基線分離[5]。

（2）采用無(wú)機(jī)和有機(jī)添加劑的方法，緩沖液中含有高濃度的中性鹽，有機(jī)添加劑如二胺類(lèi)、兩性電解質(zhì)等都能競(jìng)爭(zhēng)吸附位點(diǎn)，從而有效地抑制蛋白質(zhì)的吸附。

（3）樣品處理：典型方法是用表面活性劑SDS，SDS結(jié)合變性的蛋白，消除了蛋白質(zhì)本身的電荷量影響，使蛋白質(zhì)依靠分子量大小得以分離。

（4）對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行改性：主要是指采用物理涂敷或化學(xué)鍵合以及交聯(lián)等方法，在毛細(xì)管壁形成單分子層或交聯(lián)的涂層。通過(guò)涂層來(lái)阻止蛋白質(zhì)與毛細(xì)管壁的相互作用，以達(dá)到減小蛋白質(zhì)吸附的目的。由于涂層改變了毛細(xì)管壁的狀態(tài)，因而也會(huì)引起電滲流的變化。電中性的涂層會(huì)抑制電滲流，若是帶正電的高分子涂層則會(huì)使電滲流減小甚至反轉(zhuǎn)[6]。

（5）針對(duì)不同的被分析物，還有其他的抑制吸附的方法。任吉存，鄧延倬等在緩沖液中添加賴(lài)氨酸和精氨酸，它們?cè)谥行曰蛭A性的緩沖液里帶正電荷，能和帶負(fù)電的管壁靜電吸引結(jié)合，抑制了硅醇的解離，使相對(duì)遷移時(shí)間和相對(duì)峰高的重現(xiàn)性增強(qiáng)[7]。

毛細(xì)管電泳研究中，探索新的分離介質(zhì)和新的分離模式可以提高分離效率和毛細(xì)管電泳的適用范圍[8，9]，這方面的研究工作一直在進(jìn)展中。

3.結(jié)束語(yǔ)

毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)具有其高效，快速，樣品量少，溶劑量少等特點(diǎn)，但對(duì)于實(shí)際蛋白質(zhì)研究還存在一些問(wèn)題，如吸附問(wèn)題，分辨率問(wèn)題，復(fù)雜組分的干擾等。各種新的分離模式和探索正在進(jìn)行中。

參考文獻(xiàn)

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[9]劉玉，顧峻領(lǐng).聚合物涂層毛細(xì)管柱分離蛋白質(zhì)的研究[J].北京理工大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，4（2）：155-163.