PrepElite-GVS-LC/MSMS檢測(cè)牛奶中的硝基咪唑類藥物殘留

本文介紹的方法采用PrepElite-GVS（濃縮系統(tǒng)-GPC凝膠凈化系統(tǒng)-SPE分離系統(tǒng)）全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)對(duì)牛奶樣品進(jìn)行GPC和C18固相萃取柱凈化，并采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測(cè)其中的3種硝基咪唑類藥物殘留，3種硝基咪唑類藥物殘留的回收率均在60%～85%之間，RSD均小于7%。

在樣品前處理過(guò)程中，往往包括很多步驟，并且步步相連。萊伯泰科（LabTech）經(jīng)過(guò)多年在樣品前處理領(lǐng)域的大力開(kāi)拓，大力推出有機(jī)分析樣品前處理整體解決方案——全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)，平臺(tái)由三部分組成（濃縮系統(tǒng)-GPC凝膠凈化系統(tǒng)-SPE分離系統(tǒng)），這不但能滿足單一步驟的實(shí)驗(yàn)需求，而且可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)產(chǎn)品的在線聯(lián)機(jī)，大大簡(jiǎn)化繁瑣的樣品前處理流程，降低實(shí)驗(yàn)室工作量，提高工作效率，保證結(jié)果的平行性和準(zhǔn)確性，同時(shí)系統(tǒng)的密閉性及溶劑回收功能，也可保護(hù)操作人員免受有毒有害物質(zhì)的危害。平臺(tái)廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品檢測(cè)、農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)、生命科學(xué)等領(lǐng)域。

硝基咪唑類藥物（Nitroimidazoles）是帶有硝基的咪唑化合物，其性狀為白色或淡黃色結(jié)晶，弱堿性，能和酸結(jié)合成鹽，遇光易分解，易溶于甲醇，微溶于水，主要用于預(yù)防和治療家禽的滴蟲(chóng)病、豬的出血性下痢及厭氧菌感染，并具有促生長(zhǎng)作用，但是該類藥物對(duì)哺乳動(dòng)物具有致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性。常見(jiàn)硝基咪唑類藥物包括甲硝唑（Metronidazole）、氯甲基硝唑（5-Chloro-1-methyl-4-nitroimidazole）和苯并咪唑（5-Nitrobenzimidazole）等。這些藥物在動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)C2側(cè)鏈的氧化而被快速代謝，代謝物與原藥具有相似的潛在毒性。歐盟、北美和中國(guó)等都禁止了硝基咪唑在食品動(dòng)物中的使用。因此建立動(dòng)物食品中尤其是牛奶中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)方法具有重要意義。

本文使用PrepElite—GVS全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)使牛奶中硝基咪唑類藥物殘留檢測(cè)繁瑣的前處理過(guò)程自動(dòng)化，大大簡(jiǎn)化了人工操作，并且有較理想的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)

儀器與試劑

PrepElite-GVS： AutoClean全自動(dòng)凝膠滲析色譜凈化系統(tǒng)，附凝膠色譜柱Bio-Beads SX3，20×300mm；Sepline全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)；LiqVap全自動(dòng)定量濃縮系統(tǒng)（萊伯泰科有限公司）；

LC-MS/MS 8030（島津）；

C1 8固相萃取柱（L a b Te c h，1000mg/6mL）；

硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：甲硝唑（純度≥99.5%），苯并咪唑（純度≥98%），氯甲基硝唑（純度≥97.5%）；

乙酸乙酯（分析純和色譜純），環(huán)己烷（分析純），乙腈（分析純）；氯化鈉（分析純），磷酸氫二鉀（分析純），無(wú)水硫酸鈉（分析純），甲醇（色譜純），所用水均為超純水。

標(biāo)樣和樣品處理

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取10.0mg標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，該溶液濃度為1mg/mL，避光保存于-20℃。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別吸取儲(chǔ)備液1mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，該溶液濃度為100μg/mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：用流動(dòng)相比例水∶甲醇（85∶15）稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間液到合適的濃度。

樣品配置

在超市購(gòu)買新鮮的牛奶，以待實(shí)驗(yàn)用。

樣品提取方法

吸取牛奶試樣5.0mL，置于50mL離心管，加5mL乙腈，并用20mL乙酸乙酯進(jìn)行提取，超聲10min，離心，收集上清液；再加入20mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次。合并收集液，用無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾紙。氮吹近干濾液，乙酸乙酯∶環(huán)己烷（1∶1）定容，供GVS凈化。

樣品凈化方法

在PrepElite-GVS全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)軟件上編制硝基咪唑類藥物的凈化方法。

GPC餾分收集液在LiqVap定量濃縮近干并用甲醇置換（濃縮至5mL）。系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行C18固相萃取：柱活化，上樣體積4mL，洗脫體積15mL、氮?dú)獯蹈?。SPE上樣液和洗脫液在LiqVap濃縮近干，并用水∶甲醇（85∶15）置換，過(guò)濾膜，進(jìn)LCMS/MS檢測(cè)。

LC-MS/MS的條件

液相色譜條件：色譜柱：VP-ODS 150×2mm，2μm；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A-0.1%甲酸水溶液，B-甲醇；流速0.25mL/min，等度洗脫程序，A∶B（85∶15）。進(jìn)樣量：10μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）參數(shù)，見(jiàn)表1；脫溶劑管：250℃，加熱模塊：400℃；霧化氣流速2L/min，干燥氣流速5L/min。硝基咪唑類藥物標(biāo)液（200 ppb）GVS凈化后的TIC譜圖，見(jiàn)圖2。

結(jié)果與討論

牛奶樣品中硝基咪唑類藥物加標(biāo)進(jìn)GVS的回收率及RSD

采用加標(biāo)樣品（加標(biāo)濃度0.2mg/L），經(jīng)提取、GVS凈化處理，并用LC-MS/ MS分析，計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。3種硝基咪唑類藥物的回收率均在60%～85%之間，RSD均小于7%，見(jiàn)表2。

結(jié)論

本方法對(duì)牛奶樣品提取，并采用PrepElite-GVS（濃縮系統(tǒng)-GPC凝膠凈化系統(tǒng)-SPE分離系統(tǒng)）全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)進(jìn)行GPC和C18固相萃取柱凈化，并采用LC-MS/MS檢測(cè)其中的硝基咪唑類藥物殘留，3種硝基咪唑類藥物的回收率均在60%～85%之間，RSD均小于7%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果顯示數(shù)據(jù)理想，可用于常規(guī)的牛奶中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)。endprint

本文介紹的方法采用PrepElite-GVS（濃縮系統(tǒng)-GPC凝膠凈化系統(tǒng)-SPE分離系統(tǒng)）全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)對(duì)牛奶樣品進(jìn)行GPC和C18固相萃取柱凈化，并采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測(cè)其中的3種硝基咪唑類藥物殘留，3種硝基咪唑類藥物殘留的回收率均在60%～85%之間，RSD均小于7%。

在樣品前處理過(guò)程中，往往包括很多步驟，并且步步相連。萊伯泰科（LabTech）經(jīng)過(guò)多年在樣品前處理領(lǐng)域的大力開(kāi)拓，大力推出有機(jī)分析樣品前處理整體解決方案——全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)，平臺(tái)由三部分組成（濃縮系統(tǒng)-GPC凝膠凈化系統(tǒng)-SPE分離系統(tǒng)），這不但能滿足單一步驟的實(shí)驗(yàn)需求，而且可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)產(chǎn)品的在線聯(lián)機(jī)，大大簡(jiǎn)化繁瑣的樣品前處理流程，降低實(shí)驗(yàn)室工作量，提高工作效率，保證結(jié)果的平行性和準(zhǔn)確性，同時(shí)系統(tǒng)的密閉性及溶劑回收功能，也可保護(hù)操作人員免受有毒有害物質(zhì)的危害。平臺(tái)廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品檢測(cè)、農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)、生命科學(xué)等領(lǐng)域。

硝基咪唑類藥物（Nitroimidazoles）是帶有硝基的咪唑化合物，其性狀為白色或淡黃色結(jié)晶，弱堿性，能和酸結(jié)合成鹽，遇光易分解，易溶于甲醇，微溶于水，主要用于預(yù)防和治療家禽的滴蟲(chóng)病、豬的出血性下痢及厭氧菌感染，并具有促生長(zhǎng)作用，但是該類藥物對(duì)哺乳動(dòng)物具有致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性。常見(jiàn)硝基咪唑類藥物包括甲硝唑（Metronidazole）、氯甲基硝唑（5-Chloro-1-methyl-4-nitroimidazole）和苯并咪唑（5-Nitrobenzimidazole）等。這些藥物在動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)C2側(cè)鏈的氧化而被快速代謝，代謝物與原藥具有相似的潛在毒性。歐盟、北美和中國(guó)等都禁止了硝基咪唑在食品動(dòng)物中的使用。因此建立動(dòng)物食品中尤其是牛奶中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)方法具有重要意義。

本文使用PrepElite—GVS全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)使牛奶中硝基咪唑類藥物殘留檢測(cè)繁瑣的前處理過(guò)程自動(dòng)化，大大簡(jiǎn)化了人工操作，并且有較理想的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)

儀器與試劑

PrepElite-GVS： AutoClean全自動(dòng)凝膠滲析色譜凈化系統(tǒng)，附凝膠色譜柱Bio-Beads SX3，20×300mm；Sepline全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)；LiqVap全自動(dòng)定量濃縮系統(tǒng)（萊伯泰科有限公司）；

LC-MS/MS 8030（島津）；

C1 8固相萃取柱（L a b Te c h，1000mg/6mL）；

硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：甲硝唑（純度≥99.5%），苯并咪唑（純度≥98%），氯甲基硝唑（純度≥97.5%）；

乙酸乙酯（分析純和色譜純），環(huán)己烷（分析純），乙腈（分析純）；氯化鈉（分析純），磷酸氫二鉀（分析純），無(wú)水硫酸鈉（分析純），甲醇（色譜純），所用水均為超純水。

標(biāo)樣和樣品處理

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取10.0mg標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，該溶液濃度為1mg/mL，避光保存于-20℃。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別吸取儲(chǔ)備液1mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，該溶液濃度為100μg/mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：用流動(dòng)相比例水∶甲醇（85∶15）稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間液到合適的濃度。

樣品配置

在超市購(gòu)買新鮮的牛奶，以待實(shí)驗(yàn)用。

樣品提取方法

吸取牛奶試樣5.0mL，置于50mL離心管，加5mL乙腈，并用20mL乙酸乙酯進(jìn)行提取，超聲10min，離心，收集上清液；再加入20mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次。合并收集液，用無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾紙。氮吹近干濾液，乙酸乙酯∶環(huán)己烷（1∶1）定容，供GVS凈化。

樣品凈化方法

在PrepElite-GVS全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)軟件上編制硝基咪唑類藥物的凈化方法。

GPC餾分收集液在LiqVap定量濃縮近干并用甲醇置換（濃縮至5mL）。系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行C18固相萃?。褐罨?，上樣體積4mL，洗脫體積15mL、氮?dú)獯蹈伞PE上樣液和洗脫液在LiqVap濃縮近干，并用水∶甲醇（85∶15）置換，過(guò)濾膜，進(jìn)LCMS/MS檢測(cè)。

LC-MS/MS的條件

液相色譜條件：色譜柱：VP-ODS 150×2mm，2μm；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A-0.1%甲酸水溶液，B-甲醇；流速0.25mL/min，等度洗脫程序，A∶B（85∶15）。進(jìn)樣量：10μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）參數(shù)，見(jiàn)表1；脫溶劑管：250℃，加熱模塊：400℃；霧化氣流速2L/min，干燥氣流速5L/min。硝基咪唑類藥物標(biāo)液（200 ppb）GVS凈化后的TIC譜圖，見(jiàn)圖2。

結(jié)果與討論

牛奶樣品中硝基咪唑類藥物加標(biāo)進(jìn)GVS的回收率及RSD

采用加標(biāo)樣品（加標(biāo)濃度0.2mg/L），經(jīng)提取、GVS凈化處理，并用LC-MS/ MS分析，計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。3種硝基咪唑類藥物的回收率均在60%～85%之間，RSD均小于7%，見(jiàn)表2。

結(jié)論

本方法對(duì)牛奶樣品提取，并采用PrepElite-GVS（濃縮系統(tǒng)-GPC凝膠凈化系統(tǒng)-SPE分離系統(tǒng)）全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)進(jìn)行GPC和C18固相萃取柱凈化，并采用LC-MS/MS檢測(cè)其中的硝基咪唑類藥物殘留，3種硝基咪唑類藥物的回收率均在60%～85%之間，RSD均小于7%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果顯示數(shù)據(jù)理想，可用于常規(guī)的牛奶中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)。endprint

本文介紹的方法采用PrepElite-GVS（濃縮系統(tǒng)-GPC凝膠凈化系統(tǒng)-SPE分離系統(tǒng)）全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)對(duì)牛奶樣品進(jìn)行GPC和C18固相萃取柱凈化，并采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測(cè)其中的3種硝基咪唑類藥物殘留，3種硝基咪唑類藥物殘留的回收率均在60%～85%之間，RSD均小于7%。

在樣品前處理過(guò)程中，往往包括很多步驟，并且步步相連。萊伯泰科（LabTech）經(jīng)過(guò)多年在樣品前處理領(lǐng)域的大力開(kāi)拓，大力推出有機(jī)分析樣品前處理整體解決方案——全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)，平臺(tái)由三部分組成（濃縮系統(tǒng)-GPC凝膠凈化系統(tǒng)-SPE分離系統(tǒng)），這不但能滿足單一步驟的實(shí)驗(yàn)需求，而且可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)產(chǎn)品的在線聯(lián)機(jī)，大大簡(jiǎn)化繁瑣的樣品前處理流程，降低實(shí)驗(yàn)室工作量，提高工作效率，保證結(jié)果的平行性和準(zhǔn)確性，同時(shí)系統(tǒng)的密閉性及溶劑回收功能，也可保護(hù)操作人員免受有毒有害物質(zhì)的危害。平臺(tái)廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品檢測(cè)、農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)、生命科學(xué)等領(lǐng)域。

硝基咪唑類藥物（Nitroimidazoles）是帶有硝基的咪唑化合物，其性狀為白色或淡黃色結(jié)晶，弱堿性，能和酸結(jié)合成鹽，遇光易分解，易溶于甲醇，微溶于水，主要用于預(yù)防和治療家禽的滴蟲(chóng)病、豬的出血性下痢及厭氧菌感染，并具有促生長(zhǎng)作用，但是該類藥物對(duì)哺乳動(dòng)物具有致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性。常見(jiàn)硝基咪唑類藥物包括甲硝唑（Metronidazole）、氯甲基硝唑（5-Chloro-1-methyl-4-nitroimidazole）和苯并咪唑（5-Nitrobenzimidazole）等。這些藥物在動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)C2側(cè)鏈的氧化而被快速代謝，代謝物與原藥具有相似的潛在毒性。歐盟、北美和中國(guó)等都禁止了硝基咪唑在食品動(dòng)物中的使用。因此建立動(dòng)物食品中尤其是牛奶中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)方法具有重要意義。

本文使用PrepElite—GVS全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)使牛奶中硝基咪唑類藥物殘留檢測(cè)繁瑣的前處理過(guò)程自動(dòng)化，大大簡(jiǎn)化了人工操作，并且有較理想的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)

儀器與試劑

PrepElite-GVS： AutoClean全自動(dòng)凝膠滲析色譜凈化系統(tǒng)，附凝膠色譜柱Bio-Beads SX3，20×300mm；Sepline全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)；LiqVap全自動(dòng)定量濃縮系統(tǒng)（萊伯泰科有限公司）；

LC-MS/MS 8030（島津）；

C1 8固相萃取柱（L a b Te c h，1000mg/6mL）；

硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：甲硝唑（純度≥99.5%），苯并咪唑（純度≥98%），氯甲基硝唑（純度≥97.5%）；

乙酸乙酯（分析純和色譜純），環(huán)己烷（分析純），乙腈（分析純）；氯化鈉（分析純），磷酸氫二鉀（分析純），無(wú)水硫酸鈉（分析純），甲醇（色譜純），所用水均為超純水。

標(biāo)樣和樣品處理

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取10.0mg標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，該溶液濃度為1mg/mL，避光保存于-20℃。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別吸取儲(chǔ)備液1mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，該溶液濃度為100μg/mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：用流動(dòng)相比例水∶甲醇（85∶15）稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間液到合適的濃度。

樣品配置

在超市購(gòu)買新鮮的牛奶，以待實(shí)驗(yàn)用。

樣品提取方法

吸取牛奶試樣5.0mL，置于50mL離心管，加5mL乙腈，并用20mL乙酸乙酯進(jìn)行提取，超聲10min，離心，收集上清液；再加入20mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次。合并收集液，用無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾紙。氮吹近干濾液，乙酸乙酯∶環(huán)己烷（1∶1）定容，供GVS凈化。

樣品凈化方法

在PrepElite-GVS全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)軟件上編制硝基咪唑類藥物的凈化方法。

GPC餾分收集液在LiqVap定量濃縮近干并用甲醇置換（濃縮至5mL）。系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行C18固相萃?。褐罨?，上樣體積4mL，洗脫體積15mL、氮?dú)獯蹈?。SPE上樣液和洗脫液在LiqVap濃縮近干，并用水∶甲醇（85∶15）置換，過(guò)濾膜，進(jìn)LCMS/MS檢測(cè)。

LC-MS/MS的條件

液相色譜條件：色譜柱：VP-ODS 150×2mm，2μm；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A-0.1%甲酸水溶液，B-甲醇；流速0.25mL/min，等度洗脫程序，A∶B（85∶15）。進(jìn)樣量：10μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）參數(shù)，見(jiàn)表1；脫溶劑管：250℃，加熱模塊：400℃；霧化氣流速2L/min，干燥氣流速5L/min。硝基咪唑類藥物標(biāo)液（200 ppb）GVS凈化后的TIC譜圖，見(jiàn)圖2。

結(jié)果與討論

牛奶樣品中硝基咪唑類藥物加標(biāo)進(jìn)GVS的回收率及RSD

采用加標(biāo)樣品（加標(biāo)濃度0.2mg/L），經(jīng)提取、GVS凈化處理，并用LC-MS/ MS分析，計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。3種硝基咪唑類藥物的回收率均在60%～85%之間，RSD均小于7%，見(jiàn)表2。

結(jié)論

本方法對(duì)牛奶樣品提取，并采用PrepElite-GVS（濃縮系統(tǒng)-GPC凝膠凈化系統(tǒng)-SPE分離系統(tǒng)）全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)進(jìn)行GPC和C18固相萃取柱凈化，并采用LC-MS/MS檢測(cè)其中的硝基咪唑類藥物殘留，3種硝基咪唑類藥物的回收率均在60%～85%之間，RSD均小于7%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果顯示數(shù)據(jù)理想，可用于常規(guī)的牛奶中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)。endprint