響應(yīng)面優(yōu)化米糠多糖的超聲波輔助提取工藝研究

張 立，王紅利，劉軍海＊

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中 723001）

米糠是加工稻谷的主要副產(chǎn)物，作為飼料原料能促進(jìn)動物胃腸蠕動，提供能量，降低料肉比。飼料中加入適量的米糠，對動物生產(chǎn)也具有一定的促進(jìn)作用（白會新等，2011；張淑芳等，2009；張晶晶等，2007）。米糠多糖具有很好的經(jīng)濟(jì)效益，合理應(yīng)用可以使米糠大幅增值，米糠多糖在飼料工業(yè)中已顯示出較好的應(yīng)用前景，隨著國內(nèi)研究的不斷深入，其在飼料中將會有不可估量的作用。本文采用超聲波輔助提取米糠多糖，探討了各因素對米糠多糖提取率的影響并優(yōu)化了提取工藝，旨在為米糠多糖的研究及其資源化利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 米糠（漢中本地），葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙酸酐、濃硫酸、石油醚均為分析純。

JY92-Ⅱ型超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（上海茸研儀器有限公司）；Cary50型紫外可見分光光度計(jì)（美國瓦里安）；FW117中草藥粉碎機(jī) （天津泰斯特儀器有限公司）；SHZ-D9（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；GR-200電子天平（日本AND）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取干燥恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.5000 g放入潔凈的燒杯中，用蒸餾水溶解，移入500 mL的容量瓶中定容至刻度，搖勻，配制濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。 精密量取標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于干燥的具塞試管中，加入蒸餾水至1 mL刻度線處，再加入5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，再加5 mL濃硫酸，搖勻，室溫下放置0.5 h，用1 cm比色皿于490.00 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=0.595C-0.0115，相關(guān)系數(shù)R2=0.9978，說明在測定范圍內(nèi)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性關(guān)系良好 （式中：A為吸光度值；C為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，mg/mL）。

1.2.2 米糠多糖的提取流程 米糠→干燥粉碎→過40目篩→石油醚脫脂→揮發(fā)石油醚→干燥→超聲提取→抽濾→離心→取上清液→脫蛋白 （亞鐵氰化鉀-乙酸鋅）→離心→上清液→加入乙醇沉淀→干燥→加入蒸餾水溶解→按照1.2.1步驟測定吸光度→計(jì)算提取率。

1.2.3 米糠多糖含量計(jì)算方法 稱取1.0000 g備用的脫脂米糠粉末，放入50 mL燒杯中，加入一定量的蒸餾水，設(shè)置工藝參數(shù)進(jìn)行超聲提取，按照流程1.2.2進(jìn)行超聲波提取，按下式計(jì)算：

式中：A為多糖提取液的吸光度；Q為多糖提取液的總稀釋倍數(shù)；M為提取一次加入米糠粉末質(zhì)量，g。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 超聲波時間對米糠多糖提取率的影響 設(shè)定超聲波溫度70℃，超聲波功率200 W，料液比1∶20（g/mL），按照1.2.2的流程進(jìn)行提取，考察不同超聲波時間對米糠多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲波時間對米糠多糖提取率的影響

超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)及機(jī)械作用能有效加快分子運(yùn)動，破壞米糠的細(xì)胞壁，反應(yīng)時間過短，米糠細(xì)胞壁破壞不完全，多糖提取受阻，隨著超聲波反應(yīng)時間的延長，米糠多糖的提取率不斷增大，反應(yīng)70 min時提取率最大，超過70 min后提取率明顯減小，這可能是因?yàn)殚L時間的超聲波反應(yīng)對多糖的結(jié)構(gòu)有一定程度的破壞，故選擇超聲波時間為70 min為宜。

2.1.2 超聲波溫度對米糠多糖提取率的影響 設(shè)定超聲波時間60 min，超聲波功率200 W，料液比1∶20（g/mL），按照 1.2.2 的流程進(jìn)行提取，考察不同超聲波溫度對米糠多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲波溫度對米糠多糖提取率的影響

超聲波溫度越高，多糖分子的熱運(yùn)動就越強(qiáng)烈，增大了米糠細(xì)胞壁的破壞幾率，能有效提高多糖溶出速率。由圖2可知，隨著超聲波溫度提高，米糠多糖提取率也相應(yīng)增大，超聲波溫度為80℃時提取率最大，已達(dá)到多糖分子熱運(yùn)動的極點(diǎn)，繼續(xù)升溫，多糖分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取率顯著降低。因此，選擇80℃為較佳超聲波提取溫度。

2.1.3 料液比對米糠多糖提取率的影響 設(shè)定超聲波時間60 min，超聲波功率200 W，超聲波溫度70℃，按照1.2.2的流程進(jìn)行提取，考察不同料液比對米糠多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對米糠多糖提取率的影響

1 g米糠中的多糖含量是固定的，增大料液比擴(kuò)大了多糖分子的擴(kuò)散空間，傳質(zhì)速率提高，提取率相應(yīng)增大。由圖3可知，料液比為1∶10～1∶20（g/mL）時，米糠多糖提取率隨著料液比的減小而增大，之后提取率基本不變，料液比為1∶25（g/mL）時提取率最大，但較 1∶20（g/mL）時提取率的增幅不明顯，綜合考慮提取成本及后期純化工序，選擇 1∶20（g/mL）為較佳料液比。

2.1.4 超聲波功率對米糠多糖提取率的影響 設(shè)定超聲波時間 60 min，料液比 1∶20（g/mL），超聲波溫度70℃，按照1.2.2的流程進(jìn)行提取，考察不同超聲波功率對米糠多糖提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲波功率對米糠多糖提取率的影響

超聲波功率小，其空化作用產(chǎn)生的空化泡半徑較小，機(jī)械擠壓及摩擦作用不明顯，細(xì)胞壁破壞程度小，不利于提取。超聲波功率越大，空化作用愈強(qiáng)烈，但超聲功率增大到一定程度時容易產(chǎn)生大量無用的空化泡，增加散射衰減，形成聲屏障，反而會減弱提取效果。由圖4可知，超聲功率為250 W時多糖提取率最大；繼續(xù)增大超聲波功率，米糠多糖提取率減小，故選擇250 W為較佳超聲波功率。

3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

為了優(yōu)化米糠多糖的超聲波提取工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，固定超聲波功率250 W，選擇超聲波時間（X1）、超聲波溫度（X2）、料液比（X3）三個因素為影響因子，米糠多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及設(shè)計(jì)水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及設(shè)計(jì)水平

3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與討論 響應(yīng)面試驗(yàn)的15個試驗(yàn)點(diǎn)中，1～12為析因試驗(yàn)，13～15為零點(diǎn)試驗(yàn)，按表1進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。采用軟件RSREG對表2中的結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，回歸分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，超聲波時間（X1）、超聲波溫度（X2）及料液比（X3）對米糠多糖的提取影響極顯著，均達(dá)到0.01統(tǒng)計(jì)水平。比較各項(xiàng)系數(shù)估計(jì)值可知，各因素對米糠多糖提取的影響順序?yàn)槌暡〞r間>超聲波溫度>料液比，各平方項(xiàng)對米糠多糖的提取影響均極顯著，超聲波時間和料液比的交互作用對米糠多糖的提取影響顯著，其他交互項(xiàng)對米糠多糖提取影響不顯著，因此在實(shí)際提取過程中，可以適當(dāng)?shù)臏p少料液比，嚴(yán)格控制超聲波時間，最大化的節(jié)省提取成本。

表3 回歸分析結(jié)果

回歸分析結(jié)果顯示模型已達(dá)0.01極顯著統(tǒng)計(jì)水平，表明回歸模型與試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)吻合良好，失擬檢驗(yàn)P>0.05，說明模型中無失擬因素存在，并且R2已達(dá)98.95%，因此，此建模能成功應(yīng)用于米糠多糖的超聲波提取工藝優(yōu)化。用回歸方程對米糠多糖超聲波的提取過程進(jìn)行分析預(yù)測，軟件分析所得回歸方程為：

通過SAS軟件分析得回歸模型的最大響應(yīng)值Y=1.424566，所對應(yīng)的影響因子編碼值分別為X1=0.349158，X2=0.176187，X3=0.176885，將 X 編碼值分別回代到表1中求得對應(yīng)參數(shù)，超聲波時間73.49158 min，超聲波溫度81.76187℃，料液比1∶25.884407（g/mL），為了驗(yàn)證該模型實(shí)際生產(chǎn)操作的方便性，分別選取超聲波時間74 min，超聲波溫度82℃，料液比1∶26（g/mL）、超聲波功率250 W進(jìn)行三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，米糠多糖的平均提取率為1.4197%，與預(yù)測值的誤差僅為0.33%，說明此模型可信度高。

3.2 米糠多糖的穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一米糠多糖提取液10.0 mL室溫下密封，按照1.2.1的方法每隔1 h測定一次吸光度，連續(xù)測定6次，結(jié)果見表4。米糠多糖提取液在室溫密閉條件下6 h內(nèi)可穩(wěn)定存在，超過2 h米糠多糖含量有逐漸減小的趨勢，因此在實(shí)際應(yīng)用中最好現(xiàn)配現(xiàn)用，放置時間不宜超過2 h。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)測試結(jié)果

3.3 回收率測定試驗(yàn) 精密量取已知濃度的米糠多糖提取液同批樣品2.0 mL，分別加入不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行2次平行試驗(yàn)，按照1.2.1的方法，以空白調(diào)零，在490.00 nm處測定吸光度，按公式計(jì)算加樣回收率。米糠多糖回收率/%=（混合后測得多糖含量-提取液中多糖含量）/葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加入量×100。結(jié)果見表5，平均回收率為98.51%。

表5 回收率測定結(jié)果

4 結(jié)論

4.1 響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取米糠多糖的最佳提取工藝參數(shù)為超聲波時間74 min、超聲波溫度82 ℃、料液比 1∶26（g/mL）、超聲波功率 250 W，此條件下米糠多糖的提取率為1.4197%。

4.2 超聲波提取的米糠多糖在密閉條件下6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，放置時間不宜超過2 h；超聲波提取米糠多糖的平均回收率在98%以上，用于天然產(chǎn)物提取發(fā)展前景廣闊。

[1]白會新，單安山，鄭燕斌，等.米糠的營養(yǎng)特性及其在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國飼料，2011，14：38 ～ 40.

[2]李淑芳，張繼東，李英，等.米糠多糖對免疫抑制雞外周血CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用[J].畜牧與獸醫(yī)，2009，41（2）：59 ～ 63.

[3]張晶晶，李淑芳，鄭長山，等.米糠多糖對人工感染傳染性法氏囊病毒雛雞的保護(hù)力及 NK細(xì)胞活性的影響[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2007，3：11～14.■