載銅、載銀蒙脫石抗菌性能研究

馬悅培 ， 楊 歡 ， 張軍民 ＊， 趙青余 ， 高紅亮

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部華北動物遺傳資源與營養(yǎng)科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，北京海淀 100193；2.華東師范大學(xué)，上海閔行 200062；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州 730070；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院世界農(nóng)用林業(yè)中心 農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京海淀 100193）

蒙脫石是一種具有雙八面體層狀結(jié)構(gòu)的天然納米級鋁硅酸鹽礦物質(zhì)，因其具有較大的比表面積和層間可交換陽離子的存在，使蒙脫石具有吸附和交換性能，且其來源廣泛、價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定，可作為抗菌金屬離子的理想載體材料（韓躍新等，2006）。蒙脫石對重金屬離子的吸附特性是當(dāng)前科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，已有很多學(xué)者在這方面做了深入研究 （何宏平和郭九皋，1999）。孟艷麗（2011）研究蒙脫石、凹凸棒石及其復(fù)合物對斷奶仔豬腸道保護(hù)作用，結(jié)果表明這三種物質(zhì)能夠降低斷奶仔豬腹瀉率，具有提高仔豬飼料轉(zhuǎn)化率的趨勢。謝仲權(quán)和張軍民（2009）認(rèn)為，蒙脫石可通過對消化道內(nèi)的重金屬、細(xì)菌以及有害氣體的強(qiáng)烈吸附作用起到對動物的保健作用。胡秀榮等（2002）在含細(xì)菌數(shù)約為1×107cfu/mL的人工腸液中，加入不同量的蒙脫石，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。結(jié)果表明：蒙脫石對細(xì)菌無抑制或殺滅作用，蒙脫石對細(xì)菌的作用主要是吸附，且吸附力強(qiáng)弱與其帶電性有關(guān)中。許多重金屬離子和重金屬化合物有抗菌消毒的作用，特別是銀離子在低濃度下即具有較高生物活性。利用蒙脫石結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、吸附性強(qiáng)、離子交換容量大等特點(diǎn)，可將Cu2+、Ag+加載到其特殊結(jié)構(gòu)中，制備出天然抗菌劑，從而將蒙脫石的吸附作用與重金屬離子的殺菌作用結(jié)合起來，添加到飼料中以充分發(fā)揮蒙脫石的有利作用。

本試驗(yàn)以提純的蒙脫石為載體，制備載銅、載銀蒙脫石；對制備的四種載銅、載銀蒙脫石進(jìn)行了X射線衍射（XRD）；以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為指示菌，測定四種載銅、載銀蒙脫石的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），評價(jià)其抗菌性能，從而為載銅、載銀蒙脫石作為飼用抗生素的替代品和無機(jī)抗菌材料提供數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑 蒙脫石M1、蒙脫石M2均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所制備。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，均由華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基參考謝仲權(quán)和張軍民（2009）的方法：蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，牛肉浸出粉3～5 g/L。滅菌后，該培養(yǎng)基pH值應(yīng)為7.2±0.2。

主要試劑有：鄰苯二甲酸氫鉀、氯化銨、硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、乙醇、亞甲基藍(lán)、酚酞、焦磷酸鈉、氨水、氯化鈣、鹽酸、硝酸銅等均為分析純試劑，由國藥集團(tuán)、北京北化精細(xì)化學(xué)品公司、北京化學(xué)制劑有限公司等公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備 臺式高速離心機(jī)（H-1650型，湖南湘儀）；Ag-S電極，Cu電極，甘汞電極（上海羅素）；精密酸度計(jì)（PHC-3CT型，上海大普）；磁力攪拌器（H01-1C型，上海梅穎浦）；恒溫水浴鍋（HHS型，上海博迅）；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A1型，上海精宏）；培養(yǎng)箱（SPX-150B-2型，上海博迅）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蒙脫石載銅、載銀試驗(yàn) 載銅試驗(yàn)條件為：90 ℃水浴，反應(yīng)時間 6 h，固液比 1∶20，Cu（NO3）2濃度 0.05 mol/L，3000 r/min，離心 10 min，上清移入容量瓶，沉淀用去離子水洗滌數(shù)次，離心，每次

式中：V為溶液體積，mL；m為吸附劑用量，g；C0、C為吸附前后重金屬離子濃度，mol/L。

1.2.2 載銅、載銀蒙脫石X射線衍射 本試驗(yàn)采用DmA1x12kW粉末衍射儀，石墨彎晶單色器和 CuKα（0.15418 nm）X 射線，管電壓 40 kV，管電流100 mA，掃描方式是 θ/2θ掃描，掃描速度為 8°（2θ）/分，采數(shù)步寬為 0.01°（2θ），環(huán)境溫度為（15.0±1）℃，濕度是（20.0±5）%。 試驗(yàn)操作按照標(biāo)準(zhǔn)SY/T6210-1996進(jìn)行，委托北京北達(dá)燕園微構(gòu)分析測試中心完成。

1.2.3 載銅、載銀蒙脫石抑菌圈大小的測定 取無菌培養(yǎng)皿，分別加入約20 mL固體培養(yǎng)基，凝固作為底層，另取冷卻至50℃左右的半固體培養(yǎng)基5 mL，加入0.2 mL含菌量約106cfu/mL菌懸液，迅速搖勻倒在底層平板上，并晃動平板，使其鋪滿，作為菌層。稍干后用直徑5 mm的打孔器打孔，將4種載銅、載銀蒙脫石加于孔中，以滿而不溢為宜，并作好標(biāo)記。于37℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈大小。

1.2.4 最小抑菌濃度的測定 采用常量肉湯稀釋法，取無菌試管13支，排成一排，除第1管加入2 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基外，其余每管加入1 mL培養(yǎng)基，在第1管加入樣品0.256 g，混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1 mL棄去，第12管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為 256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL。然后在上述每管內(nèi)加入制備好的含1×106～2×106cfu/mL指示菌各1 mL，使每管最終菌液濃度約為5×105cfu/mL。第1管至第 11 管藥物濃度分別為 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL（田文瑩等，2009）。

將接種好的無菌試管塞好塞子，置30℃普通空氣孵箱中孵育24 h。以肉眼觀察，藥物最低濃離心后的上清都移入容量瓶，洗滌4次后，定溶，測定容量瓶中Cu2+的濃度，計(jì)算樣品的吸附量和利用率；載銀試驗(yàn)條件為：60℃水浴，反應(yīng)時間3 h，固液比 1∶20，AgNO3濃度 0.03 mol/L，3000 r/min，離心10 min，其他步驟同上（夏枚生等，2006）。試驗(yàn)采用離子選擇電極法測定Cu2+、Ag+濃度，計(jì)算吸附量（Q）采用公式：度管無細(xì)菌生長者，即為MIC。讀取和報(bào)告所測試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長對照管的細(xì)菌生長情況是否良好，同時還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。

1.2.5 最小殺菌濃度的測定 從制備的4種載銅、載銀蒙脫石濃度高于MIC（包括MIC）的各瓶中吸取1 mL于平板上，霉菌于28℃培養(yǎng)72 h，酵母于28℃培養(yǎng)48 h，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果，無菌生長的最低添加量為MBC。

2 結(jié)果

2.1 載銅、載銀蒙脫石中銅、銀含量 蒙脫石載銅、載銀后銅、銀含量見表1。

表1 載銅、載銀蒙脫石中Cu2+、Ag+含量

蒙脫石加載Cu2+、Ag+前后通過XRD測定的礦物成分及含量見表2，載銅、載銀蒙脫石含有蒙脫石中沒有的碳酸銀，氧化銀和孔雀石（堿式碳酸銅）。

表2 不同樣品的礦物成分及含量 %

2.2 載銅、載銀蒙脫石X射線衍射 載銅、載銀蒙脫石XRD圖譜和原蒙脫石XRD圖譜的對照見圖1、圖2，XRD圖譜無明顯差別。原蒙脫石M1的d（001）值為 14.985 ?，加載Cu2+、Ag+后的蒙脫石 M1的 d（001）值分別為14.341 ? 和 15.280 ?。 原蒙脫石M2的 d（001）值為 12.801 ?，加載 Cu2+、Ag+后的蒙脫石 M2的 d（001）值分別為 14.251 ? 和 14.985 ?。

2.3 載銅、載銀蒙脫石的抑菌圈 由表3可知，Ag+-M1、Ag+-M2抑菌圈直徑均在13.0 mm左右。抑菌圈越大，抗菌性能越好。由此可見，加載銀離子的蒙脫石具有更好的抑菌性能。

圖1 Cu2+-M1、Ag+-M1、M1 的 XRD 圖譜

圖2 Cu2+-M2、Ag+-M2、M2 的 XRD 圖譜

表3 載銅、載銀蒙脫石的抑菌圈直徑mm

2.4 載銅、載銀蒙脫石的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度 載銅、載銀蒙脫石對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC和MBC的影響，結(jié)果見表4和表5。

表4 載銅、載銀蒙脫石的MICmg/mL

表5 載銅、載銀蒙脫石的MBC

Ag+-M1對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為0.125 mg/mL和0.25 mg/mL；Ag+-M2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為0.125 mg/mL。Ag+-M2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MBC最低，分別為0.125 mg/mL和0.25 mg/mL。因此，載銀蒙脫石抗菌性能優(yōu)于載銅蒙脫石。

3 討論

3.1 載銅、載銀前后蒙脫石XRD的表征 蒙脫石的層內(nèi)四次配位和六次配位的原子發(fā)生替代而產(chǎn)生負(fù)電荷，通過層間可交換陽離子來補(bǔ)償。蒙脫石特殊的層間結(jié)構(gòu)，在加水后能發(fā)生膨脹，對陽離子具有很強(qiáng)的吸附力和交換能力。陽離子的價(jià)態(tài)與半徑均與蒙脫石的層間距有關(guān)系。蒙脫石層間距通常由XRD分析獲得的蒙脫石面網(wǎng)間距d（001）值確定。由載銅、載銀蒙脫石XRD圖譜和蒙脫石XRD圖譜（圖 1、圖 2）對比可見，原蒙脫石 M1的 d（001）值為14.985 ?，近似為鈣基蒙脫石。原蒙脫石 M2的 d（001）值為 12.801 ?，為鈉基蒙脫石（苗春省，1984）。 原蒙脫石 M1加載 Cu2+后 d（001）值變小，則搭載 Cu2+以后蒙脫石的層間距減小。在吸附Cu2+的蒙脫石及其熱處理產(chǎn)物的EPR研究中發(fā)現(xiàn)，水合銅離子進(jìn)人層間后，并不是穩(wěn)定地滯留在蒙脫石的層間，有相當(dāng)一部分Cu2+進(jìn)入到Si-O四面體片中的復(fù)三方形孔洞中，也有部分Cu2+進(jìn)入了八面體片中，這與Cu2+有較小的離子半徑關(guān)系密切 （Stadler和Schindler，1993），可能是搭載Cu2+以后蒙脫石的層間距減小的原因。Cu2+離子半徑為0.073 nm，與Al3+離子半徑0.072 nm非常相近，Cu2+進(jìn)入八面體片后，對其晶體穩(wěn)定性沒有很大的影響。大部分八面體陽離子仍保持原位置未變，故并沒有改變其原有的晶體結(jié)構(gòu)（何宏平和郭九皋，1999）。因此，蒙脫石在加載銅離子、銀離子后仍保持很好的吸附性能，以保證發(fā)揮較好的抗菌性能。 原蒙脫石 M2加載 Cu2+后 d（001）值變小，則搭載Cu2+以后蒙脫石的層間距增大，這可能是因?yàn)榇蟛糠纸粨Q的Cu2+以水和離子形式存在層間。原蒙脫石M1、M2加載 Ag+后 d（001）值都變大，則搭載 Ag+以后蒙脫石的層間距增大。由于鈣的離子半徑（0.1 nm）和鈉的離子半徑 （0.092 nm）比銀的離子半徑（0.126 nm）小，所以當(dāng)銀離子通過離子交換的方式進(jìn)入層間后，會使得層間距增大（余煥煥等，2013）。

蒙脫石加載銅離子、銀離子前后通過XRD測定的礦物成分及含量，載銅、載銀蒙脫石含有蒙脫石原礦中沒有的碳酸銀，氧化銀和孔雀石（堿式碳酸銅），說明Cu2+、Ag+加載到蒙脫石后存在氧化現(xiàn)象。銀離子無論是在見光、受熱等條件下都極易還原成金屬銀。銀離子還能與水介質(zhì)中的多種陰離子反應(yīng)，形成不溶于水的AgCl等。因此，實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)保證適宜的載銀量以降低原料成本和防止無機(jī)抗菌材料的氧化變色，制備的礦物抗菌劑應(yīng)盡快密封保存，盡量避免Cu2+、Ag+被氧化而影響殺菌效果。

3.2 載銅、載銀蒙脫石抗菌機(jī)理與抗菌效果 天然礦物抗菌劑的作用機(jī)理有以下幾種假說：有觀點(diǎn)認(rèn)為，蒙脫石加載Cu2+、Ag+，與指示菌接觸后，由于Cu2+、Ag+的還原性較強(qiáng)，離子交換所吸附的離子逐漸從層間域中溶出，而和細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)合在一起，并穿透細(xì)胞壁，通過和細(xì)菌中的蛋白質(zhì)和核酸反應(yīng)，阻礙細(xì)菌的生物合成和能量傳遞，引起細(xì)菌酶蛋白變性和細(xì)胞膜生物學(xué)性質(zhì)的破壞和損傷，使細(xì)菌失活，從而達(dá)到較好的殺菌效果 （Alvarez-Puebla等，2004）。也有一種觀點(diǎn)認(rèn)為，載銅蒙脫石具有較好的殺菌活性是因?yàn)?，搭載銅離子后的蒙脫石表面電荷發(fā)生變化，增強(qiáng)了蒙脫石與細(xì)菌的靜電吸附作用。另外，還有一種解釋認(rèn)為，銀離子具有催化氧化性能，能氧化空氣和水中的氧形成羥基自由基和活性氧離子，破壞微生物的繁殖能力，起到抑菌和殺菌作用。

余志偉等 （2003）殺菌試驗(yàn)表明，膨潤土與Ag+、Cu2+、Zn2+三種金屬離子制得的抗菌材料，都具有很好的殺菌抑菌效果，對大腸桿菌的殺滅率為100%，是理想的抗菌材料，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果較相符。加載銀離子的抗菌劑的抗菌性能優(yōu)于加載銅離子的抗菌劑，這可能是由于抗菌劑的抑菌性能與加載的金屬離子相關(guān)。Cu2+由于化學(xué)活性弱于Ag+，故其抑菌效果稍差。馬玉龍和郭彤（2007）有關(guān)載銅蒙脫石及其殺滅大腸桿菌機(jī)制的研究中得出結(jié)論為載銅蒙脫石對大腸桿菌的MIC和MBC分別為0.16 mg/mL和0.64 mg/mL。本試驗(yàn)的結(jié)果與其存在一定差距，可能原因是蒙脫石原礦間存在的差異以及銀離子的吸附條件導(dǎo)致的吸附量不同，而影響其抗菌性能。王寧等（2000）有關(guān)非金屬礦物在抗菌材料中的應(yīng)用的研究中表明，載銀蒙脫石對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的的MIC分別為125 mg/L和250 mg/L，本試驗(yàn)的結(jié)果與其結(jié)論基本一致。

4 結(jié)論

載銅、載銀后的蒙脫石層間距發(fā)生變化，其優(yōu)異的吸附性和膠體性能依然存在。載銅、載銀蒙脫石對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抗菌性能，載銀蒙脫石的抗菌效果優(yōu)于載銅蒙脫石。

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