一種黑曲霉斜面培養(yǎng)基的優(yōu)化方法

柴敏

摘 要：通過一系列實驗，優(yōu)化了黑曲霉Co827的斜面培養(yǎng)基配比。優(yōu)化后的斜面培養(yǎng)基為3.5°Be～3.6°Be麥芽汁培養(yǎng)基。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，單菌落孢子數(shù)達到167.2×105左右，產(chǎn)孢子能力提高了15.07%，通過搖瓶驗證，產(chǎn)酸達到14.40%，提高了3%左右。

關(guān)鍵詞：黑曲霉Co827 斜面培養(yǎng)基 麥芽汁 優(yōu)化

中圖分類號：TQ925 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2014）08（c）-0231-02

Abstract：A series of experiments is carried out in the study to optimize components of the Agarslantculture Medium for Aspergillus niger Co827.The optimal Agarslantculture Medium contains 3.5°Be～3.6°Be malt extract. Spore number from single colony reaches 167.2×105，that is 15.07% more compared with original by using optimal Agarslantculture Medium.14.40% Citric Acid accumulated in shaking flask is 3% more compared with original by confirmatory flask-shaking fermentation.

Key Words：Aspergillus Niger Co827；Agarslantculture Medium；Malt Extract；Optimize

黑曲霉Co827是目前國內(nèi)大多數(shù)檸檬酸廠家廣泛使用的菌種，該菌種尤其適合以木薯干、玉米等淀粉質(zhì)原料的發(fā)酵[1，2]。該菌種的擴大培養(yǎng)普遍采用小試管斜面培養(yǎng)—大試管斜面培養(yǎng)—三角瓶培養(yǎng)—鋼瓶—種子罐五級培養(yǎng)方式，然后接入大發(fā)酵罐發(fā)酵。其中，斜面培養(yǎng)階段提供的是大量的孢子，此階段孢子著生的旺衰直接影響后續(xù)菌種活力乃至大罐發(fā)酵水平[3]。衡量孢子著生旺衰（行業(yè)內(nèi)成之為活力）的指標(biāo)是單菌落孢子數(shù)和可轉(zhuǎn)接大試管數(shù)，然后檢測搖瓶產(chǎn)酸酸度加以驗證。目前國內(nèi)大部分采取清液發(fā)酵技術(shù)的廠家普遍采用的培養(yǎng)基是3.0°Be麥芽汁[4]或土豆汁培養(yǎng)基，部分廠家在培養(yǎng)基里還添加營養(yǎng)鹽。目前國內(nèi)廠家黑曲霉Co827單菌落孢子數(shù)約在145×105～146×105，搖瓶酸度約14.0%左右。筆者在本實驗中利用顯微鏡觀察不同組分的斜面培養(yǎng)基上黑曲霉菌落形態(tài)，進而測得單菌落孢子數(shù)，找出最優(yōu)配方和濃度，并在搖床上培養(yǎng)96 h測得搖瓶酸度進行驗證。

1 材料和方法

1.1 菌種

黑曲霉Co827，菌落生長較快，菌落凸起，邊緣整齊，菌落較小，帶皺折，培養(yǎng)4天孢子呈黑色。96 h搖瓶產(chǎn)酸14.0%。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 平板培養(yǎng)基

（1）麥芽汁培養(yǎng)基：2.0°Be～6.0°Be麥芽汁，瓊脂1.7%，pH自然。

（2）麥芽汁營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基：3.0°Be麥芽汁，MgSO4.7H2O 0.15%、K2HPO40.36%，（NH4）2SO4 0.2%，瓊脂1.7%，pH自然。

（3）土豆汁培養(yǎng)基（PDA）：土豆汁，葡萄糖2%，瓊脂1.7%，pH自然。

（4）土豆汁營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基：土豆汁，葡萄糖2%，MgSO4.7H20 0.15%，K2HPO40.36%，（NH4）2SO4 0.2%，瓊脂1.7%，pH自然。

1.2.2 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基

玉米粉液化液15%，玉米液化液清液85%，pH自然。

1.3 主要儀器及設(shè)備

超凈工作臺（安徽省航天凈化設(shè)備有限公司）。

血球計數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司）。

恒溫培養(yǎng)箱（杭州藍天化學(xué)儀器廠）。

恒溫搖床（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）。

顯微鏡（上海光學(xué)儀器六廠）。

恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1平板培養(yǎng)方法

將菌懸液用玻璃珠打散后搖勻，用吸管取0.1 ml滴入制作好的不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，35 ℃培養(yǎng)96 h。

1.4.2 搖瓶培養(yǎng)方法

250 ml三角瓶內(nèi)裝有消好的搖瓶培養(yǎng)基40 ml，將菌種自平板挑入三角瓶中，放入搖床，35 ℃，300 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)96 h。

1.5 平板上菌落孢子計數(shù)

取100 μl滅菌水沖洗孢子，吸出孢子菌懸液至于EP（eppendorf）管中，取1 μl滴于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，不要有氣泡，然后在血球計數(shù)上查數(shù)孢子。

1.6 搖瓶酸度測定[5]

取1 ml搖瓶發(fā)酵液，以酚酞作為指示劑，以0.1429～0.1430 mol/L NaOH溶液滴定至淡粉紅色，所消耗的NaOH毫升數(shù)即為搖瓶酸度。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)培養(yǎng)基組分的確定

分別采用不同波美度的麥芽汁、麥芽汁營養(yǎng)鹽、土豆汁、土豆汁營養(yǎng)鹽作培養(yǎng)基，將黑曲霉生產(chǎn)菌種培養(yǎng)96 h，在顯微鏡下觀測菌落生長情況。采用不同培養(yǎng)基96 h菌落形態(tài)如圖1所示。

從圖1可以看出，3.0°Be麥芽汁培養(yǎng)基和4.0°Be麥芽汁培養(yǎng)基上菌落形態(tài)規(guī)整，顏色較深，邊緣清晰，長勢較為旺盛。

將每個培養(yǎng)基做三個平行樣品，測定小試管中每個各個菌落的孢子數(shù)，取平均值。然后，將小試管中菌落轉(zhuǎn)接進大試管。測定結(jié)果見表1。endprint

從表1可以看出，3.0°Be及4.0°Be麥芽汁培養(yǎng)基的單菌落長孢子數(shù)分別為148.3×105和127.3×105，且可轉(zhuǎn)接大試管數(shù)均為30。所以，可以初步判定3.0°Be～4.0°Be的麥芽汁培養(yǎng)基為較優(yōu)培養(yǎng)基，最為適合Co827的生長。

2.2 最優(yōu)培養(yǎng)基濃度的確定

為了進一步確定最優(yōu)麥芽汁濃度，以0.1°Be為一濃度梯度，每一梯度培養(yǎng)基做三個平行樣，測定單菌落孢子數(shù)，然后將單菌落接入三角瓶進行搖瓶發(fā)酵（起始糖液總糖為14.9%），測定96 h搖瓶酸度和96 h還原糖值，取三個平行樣的平均值。測定結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，隨著麥芽汁濃度的升高，單菌落孢子數(shù)逐步上升，3.5°Be～3.6°Be時達到峰值，為167.2×105左右，此后逐步下降。因此可以結(jié)論，3.5°Be～3.6°Be為最優(yōu)麥芽汁培養(yǎng)基濃度。

同時，從表2中可以看出，3.5°Be～ 3.6°Be時，14.40%左右的搖瓶產(chǎn)酸也為最高，而還原糖降低到0.50%～0.51%左右，說明糖酸轉(zhuǎn)化率也較高。這一點再次證實了孢子數(shù)越多，菌種活力越強，產(chǎn)酸能力越高[7]，證實了3.5°Be～3.6°Be為最優(yōu)麥芽汁培養(yǎng)基濃度。

3 結(jié)論

采用3.5°Be～3.6°Be麥芽汁培養(yǎng)基，單菌落孢子數(shù)達到167.2×105左右，產(chǎn)酸為14.40%左右，相對于現(xiàn)生產(chǎn)上普遍使用的3.0°Be麥芽汁培養(yǎng)基，產(chǎn)孢子能力提高了15.07%，搖瓶產(chǎn)酸提高了3.1%左右，這對于提高后續(xù)菌種活力，提高產(chǎn)酸水平，降低檸檬酸的生產(chǎn)成本具有重要意義。

參考文獻

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[3] 儲炬，李友榮.現(xiàn)代工業(yè)9發(fā)酵調(diào)控學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：250-253.

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[7] 儲炬，李友榮.現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵調(diào)控學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：43-48.endprint

從表1可以看出，3.0°Be及4.0°Be麥芽汁培養(yǎng)基的單菌落長孢子數(shù)分別為148.3×105和127.3×105，且可轉(zhuǎn)接大試管數(shù)均為30。所以，可以初步判定3.0°Be～4.0°Be的麥芽汁培養(yǎng)基為較優(yōu)培養(yǎng)基，最為適合Co827的生長。

2.2 最優(yōu)培養(yǎng)基濃度的確定

為了進一步確定最優(yōu)麥芽汁濃度，以0.1°Be為一濃度梯度，每一梯度培養(yǎng)基做三個平行樣，測定單菌落孢子數(shù)，然后將單菌落接入三角瓶進行搖瓶發(fā)酵（起始糖液總糖為14.9%），測定96 h搖瓶酸度和96 h還原糖值，取三個平行樣的平均值。測定結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，隨著麥芽汁濃度的升高，單菌落孢子數(shù)逐步上升，3.5°Be～3.6°Be時達到峰值，為167.2×105左右，此后逐步下降。因此可以結(jié)論，3.5°Be～3.6°Be為最優(yōu)麥芽汁培養(yǎng)基濃度。

同時，從表2中可以看出，3.5°Be～ 3.6°Be時，14.40%左右的搖瓶產(chǎn)酸也為最高，而還原糖降低到0.50%～0.51%左右，說明糖酸轉(zhuǎn)化率也較高。這一點再次證實了孢子數(shù)越多，菌種活力越強，產(chǎn)酸能力越高[7]，證實了3.5°Be～3.6°Be為最優(yōu)麥芽汁培養(yǎng)基濃度。

3 結(jié)論

采用3.5°Be～3.6°Be麥芽汁培養(yǎng)基，單菌落孢子數(shù)達到167.2×105左右，產(chǎn)酸為14.40%左右，相對于現(xiàn)生產(chǎn)上普遍使用的3.0°Be麥芽汁培養(yǎng)基，產(chǎn)孢子能力提高了15.07%，搖瓶產(chǎn)酸提高了3.1%左右，這對于提高后續(xù)菌種活力，提高產(chǎn)酸水平，降低檸檬酸的生產(chǎn)成本具有重要意義。

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[7] 儲炬，李友榮.現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵調(diào)控學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：43-48.endprint

從表1可以看出，3.0°Be及4.0°Be麥芽汁培養(yǎng)基的單菌落長孢子數(shù)分別為148.3×105和127.3×105，且可轉(zhuǎn)接大試管數(shù)均為30。所以，可以初步判定3.0°Be～4.0°Be的麥芽汁培養(yǎng)基為較優(yōu)培養(yǎng)基，最為適合Co827的生長。

2.2 最優(yōu)培養(yǎng)基濃度的確定

為了進一步確定最優(yōu)麥芽汁濃度，以0.1°Be為一濃度梯度，每一梯度培養(yǎng)基做三個平行樣，測定單菌落孢子數(shù)，然后將單菌落接入三角瓶進行搖瓶發(fā)酵（起始糖液總糖為14.9%），測定96 h搖瓶酸度和96 h還原糖值，取三個平行樣的平均值。測定結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，隨著麥芽汁濃度的升高，單菌落孢子數(shù)逐步上升，3.5°Be～3.6°Be時達到峰值，為167.2×105左右，此后逐步下降。因此可以結(jié)論，3.5°Be～3.6°Be為最優(yōu)麥芽汁培養(yǎng)基濃度。

同時，從表2中可以看出，3.5°Be～ 3.6°Be時，14.40%左右的搖瓶產(chǎn)酸也為最高，而還原糖降低到0.50%～0.51%左右，說明糖酸轉(zhuǎn)化率也較高。這一點再次證實了孢子數(shù)越多，菌種活力越強，產(chǎn)酸能力越高[7]，證實了3.5°Be～3.6°Be為最優(yōu)麥芽汁培養(yǎng)基濃度。

3 結(jié)論

采用3.5°Be～3.6°Be麥芽汁培養(yǎng)基，單菌落孢子數(shù)達到167.2×105左右，產(chǎn)酸為14.40%左右，相對于現(xiàn)生產(chǎn)上普遍使用的3.0°Be麥芽汁培養(yǎng)基，產(chǎn)孢子能力提高了15.07%，搖瓶產(chǎn)酸提高了3.1%左右，這對于提高后續(xù)菌種活力，提高產(chǎn)酸水平，降低檸檬酸的生產(chǎn)成本具有重要意義。

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