小薊中綠原酸的UPLC分析

段紅波等

摘要：采用超高效液相色譜法（UPLC）測定小薊（Cephalanoplos segetum）中綠原酸含量。其中色譜柱為Acquity-BEH C18 （50×2.5 mm，1.7 μm）；流動相A和B分別為甲醇和0.1%（V/V）磷酸-水溶液，梯度洗脫，流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL；檢測5.0 min；檢測波長327 nm。在該色譜條件下，小薊中的綠原酸無干擾峰，含量在5.0～60.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗結(jié)果的RSD分別為0.79%、2.70%和2.52%，平均回收率達(dá)101.0%。漢中小薊中的綠原酸含量為2.15±0.06 mg/g。色譜方法快速、簡便、穩(wěn)定、可靠，為小薊及其他植物材料中綠原酸的含量分析提供了參考。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜法（UPLC）；小薊（Cephalanoplos segetum）；綠原酸；含量測定

中圖分類號：Q599 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3901-03

Abstract： The content of chlorogenic acid in Cephalanoplos segetum was analyzed with UPLC. The 5.0 μL sample was separated by Acquity BEH C18（50×2.5 mm，1.9 μm） with the gradient elution of methanol （A） and 0.1% H3PO4 solution （B） at the flow rate of 0.3 mL/min in 30 ℃ and detected at 327 nm for 5 min. The results showed that the linear detection range was 5.0～60.0 g/mL. RSD of precision， repeatability and stability was 0.79%， 2.70% and 2.52%， respectively. The recovery was 101.0%. The content of chlorogenic acid in Cephalanoplos segetum from Hanzhong was 2.15±0.06 mg/g. The chromatographic method was rapid， simple， stable and reliable. It will provide a reference for detecting chlorogenic acid in Cephalanoplos segetum and other plant.

Key words： UPLC； Cephalanoplos segetum； chlorogenic acid； determination

小薊（Cephalanoplos segetum）別名野紅花、小刺蓋、刺兒菜等，為菊科薊屬植物，藥用部分為干燥的地上部分。小薊莖呈圓柱形，上部有分枝，長5～30 cm， 直徑0.2～0.5 cm；表面為灰綠色或紫色，具縱棱及白色柔毛；質(zhì)脆，易折斷，斷面中空。葉互生，無柄或有短柄；葉片上表面為綠褐色，下表面為灰綠色，表面均具白色柔毛。頭狀花序單個或數(shù)個頂生；總苞鐘狀，苞片5～8層，黃綠色，花紫紅色；氣微，味微苦[1]。小薊具有涼血止血，祛淤消腫的功效，可用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏下血，外傷出血，癰腫瘡毒等，為中醫(yī)臨床常用藥。分布于中國大部分地區(qū)，中歐、東歐、俄羅斯東部、日本、朝鮮亦有分布。一般生于荒地、草地、山坡林、路旁、灌叢、田間、林緣及溪旁，也有人工栽培作藥用[2]。

小薊中的有效成分比較復(fù)雜，含有機(jī)酸類、黃酮類、三萜類等化合物，其中綠原酸是小薊促進(jìn)血液凝固，止血的主要功效成分[3-6]。綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)等作用[7]。檢測小薊中綠原酸含量對小薊的品質(zhì)評價以及綜合開發(fā)具有重要意義。

目前，檢測綠原酸的主要方法包括：分光光度法[8]、高效液相色譜法（HPLC）[9， 10]等。其中，基于HPLC建立的超高效液相色譜（Ultra PerformanceLiquid Chromatography，UPLC）技術(shù)，不僅可提高分析通量、靈敏度及色譜峰容量，更可極大提高檢測效率。本試驗通過優(yōu)化條件，建立了一種適用于綠原酸的UPLC分析方法，以期為小薊的功能評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小薊采自于陜西省漢中市，經(jīng)植物分類學(xué)副教授李會寧老師鑒定為小薊。將小薊洗干凈，40 ℃烘箱烘干，粉碎機(jī)粉碎過60目篩，密封，冷藏備用；綠原酸（98%，上海同田生物科技有限公司）。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY-UPLC帶PDA檢測器（美國Waters公司）；AUY220萬分之一電子天平，AUW220D 1/100 000電子天平（日本島津公司）；KQ100-DA超聲波儀（江蘇省昆山市淀山湖超聲儀器有限公司）；101-3A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（滬南電爐烘箱廠）；FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

甲醇（色譜純，Burdick and Jackson 公司）；甲醇（分析純，天津市登峰化學(xué)試劑廠）；去離子水（娃哈哈食品有限公司）；磷酸（分析純，西安化學(xué)試劑二廠）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 準(zhǔn)確稱取2.50 mg 綠原酸， 用50%（V/V，下同）甲醇-水溶液溶解并定容至25.0 mL棕色容量瓶中，得100.0 μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對照品母液。endprint

1.3.2 色譜條件 色譜柱為Acquity-BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）；流動相：A為甲醇，B為0.1%（V/V）磷酸水溶液，采用梯度洗脫，梯度為10%A（0 min）-50%A（4.0 min）-10%A（4.5 min）-10%A（5.0 min）；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5.0 μL，檢測時間5.0 min；檢測波長326 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備 吸取不同綠原酸標(biāo)準(zhǔn)母液0.5～6.0 mL用50%（體積比）甲醇-水溶液定容至10.0 mL棕色容量瓶中，配制不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。經(jīng)0.25 μm 微孔濾膜過濾后，按照設(shè)定條件進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.4 樣品溶液的制備 稱取0.2 g樣品，加40%甲醇-水溶液25.0 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min，再次稱定質(zhì)量，不足部分用40%甲醇補(bǔ)足。取小薊的甲醇提取液3.0 mL，過0.25 μm微孔濾膜，按照設(shè)定色譜條件進(jìn)樣5.0 μL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算小薊中綠原酸的含量。設(shè)3組平行。

1.3.5 方法評價 按“1.3.4”制備樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積和RSD，考察方法精密度；按“1.3.4”制備5份樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下，進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法重復(fù)性；按“1.3.4”制備樣品溶液，按“1.3.2”色譜條件下，分別于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法穩(wěn)定性；稱取已測定綠原酸為2.15 mg/g的小薊樣品0.20 g，加入100.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液1 mL，同上法提取和分析，測定含量，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長確定

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的200～400 nm紫外吸收光譜圖見圖1。由圖1可知，綠原酸最大紫外吸收波長為327 nm，參考文獻(xiàn)[11，12]，本試驗采用327 nm作為檢測波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2。以綠原酸的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為y=316.20x-21.25，r=0.999 3，結(jié)果表明綠原酸在5.0～60.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 精密度 按上述方法分析計算峰面積的RSD為0.79%（n=5），表明在該條件下方法精密度良好（RSD<3%）。

2.3.2 重復(fù)性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.70%（n=5），表明在該條件下方法重復(fù)性良好（RSD<3%）。

2.3.3 穩(wěn)定性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.52%（n=5），表明在該條件下，綠原酸穩(wěn)定性較好（RSD<3%），從峰面積上看，綠原酸隨著時間延長，其含量會降低。

2.3.4 回收率 按上述方法測定綠原酸的加樣回收率，回收率結(jié)果見表1。

綠原酸回收率結(jié)果表明，平均回收率為101.0%，RSD為2.19%，滿足分析要求（RSD<3%）。

2.4 樣品測定結(jié)果

按照測定樣品溶液制備方法，平行制備樣品溶液3份，在上述條件下分析檢測，小薊中的綠原酸含量結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，樣品中的綠原酸含量為2.15 mg/g，平行測定的5組小薊中綠原酸含量差異不顯著。

3 討論

預(yù)試驗曾比較了體積比為10%～100%甲醇-水溶液提取效果，結(jié)果表明采用40%甲醇-水溶液提取樣品中的綠原酸峰面積最大，因此，選擇40%甲醇-水溶液為提取劑，后續(xù)試驗將重點圍繞提取劑條件中的超聲波功率、料液比、提取時間等因素展開。本試驗測定小薊中的綠原酸含量為2.15 mg/g，該結(jié)果與周建青等[8]，陳毓[9]，侯坤等[10]報道結(jié)果一致，但小于已報道的金銀花[11]和杜仲[13]中綠原酸含量。因此，綠原酸含量可能不能真實反映小薊品質(zhì)特征，后續(xù)研究可圍繞其他活性物質(zhì)開展分析[14， 15]。

另外，小薊在《中國藥典（2000版）》僅作了性狀和顯微描述，缺乏品質(zhì)控制標(biāo)準(zhǔn)和分析方法，而在藥典（2005版）中小薊品質(zhì)方面規(guī)定雖然有所增加，但相關(guān)檢測方法仍有不足，《藥典（2010版）》建立了小薊中有效成分含量檢測的通用方法。本試驗采用的UPLC法作為一種新型高效液相分析方法，具有精密度高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確可靠，簡便快速等特點，可為小薊中其他組分分析提供技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上?？萍汲霭嫔?， 2005.

[2] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[3] 于生蘭，張 龍，孫 玲.金銀花的研究進(jìn)展[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2002，13（8）：498-500.

[4] 陳 毓， 丁安偉，楊星昊，等. 小薊化學(xué)成分藥理作用及臨床應(yīng)用研究述要[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（4）：614-615.

[5] 楊星昊， 崔敬浩，丁安偉.小薊提取物對凝血、出血及實驗性炎癥的影響[J]. 四川中醫(yī)，2006，24（1）：17.

[6] 魏 彥，邱乃英，歐陽青. 大薊、小薊的鑒別與臨床應(yīng)用[J]. 北京中醫(yī)雜志，2002，21（5）：296-297.

[7] 黃紹重. 綠原酸的提取及應(yīng)用[J]. 應(yīng)用化工，2006，35（6）： 467-469.

[8] 周建青， 徐愛列， 王國鋒. 不同測定方法測定小薊中綠原酸含量的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（27）：12902-12903.

[9] 陳 毓. RP-HPLC測定小薊中綠原酸的含量[J]. 中國現(xiàn)代中藥， 2007，9（9）：12-14.

[10] 侯 坤，許 浚，張鐵軍. HPLC同時測定小薊中蒙花苷和綠原酸的含量[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：62-64.

[11] 江 海，魏 巍，丁 銳.HPLC測定漢中地區(qū)金銀花中綠原酸含量[J]. 陜西理工學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，22（1）：87-90.

[12] 江 海. 陜西略陽杜仲葉中綠原酸的含量分析[J]. 光譜實驗室， 2012， 29（2）： 757-761.

[13] 周 蘭，熊慧林.RP-HPLC法測定杜仲葉中綠原酸的含量[J]. 首都醫(yī)藥，2009，16（6）：56.

[14] 曹 琴，陳建濤.小薊的化學(xué)成分研究[J].藥學(xué)實踐雜志， 2010，28（4）：271-274.

[15] 葸玉琴，梁孔賢，常河林，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取小薊中黃酮類化合物[J].西北師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2011，47（6）：63-70.endprint

1.3.2 色譜條件 色譜柱為Acquity-BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）；流動相：A為甲醇，B為0.1%（V/V）磷酸水溶液，采用梯度洗脫，梯度為10%A（0 min）-50%A（4.0 min）-10%A（4.5 min）-10%A（5.0 min）；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5.0 μL，檢測時間5.0 min；檢測波長326 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備 吸取不同綠原酸標(biāo)準(zhǔn)母液0.5～6.0 mL用50%（體積比）甲醇-水溶液定容至10.0 mL棕色容量瓶中，配制不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。經(jīng)0.25 μm 微孔濾膜過濾后，按照設(shè)定條件進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.4 樣品溶液的制備 稱取0.2 g樣品，加40%甲醇-水溶液25.0 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min，再次稱定質(zhì)量，不足部分用40%甲醇補(bǔ)足。取小薊的甲醇提取液3.0 mL，過0.25 μm微孔濾膜，按照設(shè)定色譜條件進(jìn)樣5.0 μL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算小薊中綠原酸的含量。設(shè)3組平行。

1.3.5 方法評價 按“1.3.4”制備樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積和RSD，考察方法精密度；按“1.3.4”制備5份樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下，進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法重復(fù)性；按“1.3.4”制備樣品溶液，按“1.3.2”色譜條件下，分別于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法穩(wěn)定性；稱取已測定綠原酸為2.15 mg/g的小薊樣品0.20 g，加入100.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液1 mL，同上法提取和分析，測定含量，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長確定

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的200～400 nm紫外吸收光譜圖見圖1。由圖1可知，綠原酸最大紫外吸收波長為327 nm，參考文獻(xiàn)[11，12]，本試驗采用327 nm作為檢測波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2。以綠原酸的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為y=316.20x-21.25，r=0.999 3，結(jié)果表明綠原酸在5.0～60.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 精密度 按上述方法分析計算峰面積的RSD為0.79%（n=5），表明在該條件下方法精密度良好（RSD<3%）。

2.3.2 重復(fù)性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.70%（n=5），表明在該條件下方法重復(fù)性良好（RSD<3%）。

2.3.3 穩(wěn)定性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.52%（n=5），表明在該條件下，綠原酸穩(wěn)定性較好（RSD<3%），從峰面積上看，綠原酸隨著時間延長，其含量會降低。

2.3.4 回收率 按上述方法測定綠原酸的加樣回收率，回收率結(jié)果見表1。

綠原酸回收率結(jié)果表明，平均回收率為101.0%，RSD為2.19%，滿足分析要求（RSD<3%）。

2.4 樣品測定結(jié)果

按照測定樣品溶液制備方法，平行制備樣品溶液3份，在上述條件下分析檢測，小薊中的綠原酸含量結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，樣品中的綠原酸含量為2.15 mg/g，平行測定的5組小薊中綠原酸含量差異不顯著。

3 討論

預(yù)試驗曾比較了體積比為10%～100%甲醇-水溶液提取效果，結(jié)果表明采用40%甲醇-水溶液提取樣品中的綠原酸峰面積最大，因此，選擇40%甲醇-水溶液為提取劑，后續(xù)試驗將重點圍繞提取劑條件中的超聲波功率、料液比、提取時間等因素展開。本試驗測定小薊中的綠原酸含量為2.15 mg/g，該結(jié)果與周建青等[8]，陳毓[9]，侯坤等[10]報道結(jié)果一致，但小于已報道的金銀花[11]和杜仲[13]中綠原酸含量。因此，綠原酸含量可能不能真實反映小薊品質(zhì)特征，后續(xù)研究可圍繞其他活性物質(zhì)開展分析[14， 15]。

另外，小薊在《中國藥典（2000版）》僅作了性狀和顯微描述，缺乏品質(zhì)控制標(biāo)準(zhǔn)和分析方法，而在藥典（2005版）中小薊品質(zhì)方面規(guī)定雖然有所增加，但相關(guān)檢測方法仍有不足，《藥典（2010版）》建立了小薊中有效成分含量檢測的通用方法。本試驗采用的UPLC法作為一種新型高效液相分析方法，具有精密度高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確可靠，簡便快速等特點，可為小薊中其他組分分析提供技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海科技出版社， 2005.

[2] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[3] 于生蘭，張 龍，孫 玲.金銀花的研究進(jìn)展[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2002，13（8）：498-500.

[4] 陳 毓， 丁安偉，楊星昊，等. 小薊化學(xué)成分藥理作用及臨床應(yīng)用研究述要[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（4）：614-615.

[5] 楊星昊， 崔敬浩，丁安偉.小薊提取物對凝血、出血及實驗性炎癥的影響[J]. 四川中醫(yī)，2006，24（1）：17.

[6] 魏 彥，邱乃英，歐陽青. 大薊、小薊的鑒別與臨床應(yīng)用[J]. 北京中醫(yī)雜志，2002，21（5）：296-297.

[7] 黃紹重. 綠原酸的提取及應(yīng)用[J]. 應(yīng)用化工，2006，35（6）： 467-469.

[8] 周建青， 徐愛列， 王國鋒. 不同測定方法測定小薊中綠原酸含量的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（27）：12902-12903.

[9] 陳 毓. RP-HPLC測定小薊中綠原酸的含量[J]. 中國現(xiàn)代中藥， 2007，9（9）：12-14.

[10] 侯 坤，許 浚，張鐵軍. HPLC同時測定小薊中蒙花苷和綠原酸的含量[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：62-64.

[11] 江 海，魏 巍，丁 銳.HPLC測定漢中地區(qū)金銀花中綠原酸含量[J]. 陜西理工學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，22（1）：87-90.

[12] 江 海. 陜西略陽杜仲葉中綠原酸的含量分析[J]. 光譜實驗室， 2012， 29（2）： 757-761.

[13] 周 蘭，熊慧林.RP-HPLC法測定杜仲葉中綠原酸的含量[J]. 首都醫(yī)藥，2009，16（6）：56.

[14] 曹 琴，陳建濤.小薊的化學(xué)成分研究[J].藥學(xué)實踐雜志， 2010，28（4）：271-274.

[15] 葸玉琴，梁孔賢，常河林，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取小薊中黃酮類化合物[J].西北師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2011，47（6）：63-70.endprint

1.3.2 色譜條件 色譜柱為Acquity-BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）；流動相：A為甲醇，B為0.1%（V/V）磷酸水溶液，采用梯度洗脫，梯度為10%A（0 min）-50%A（4.0 min）-10%A（4.5 min）-10%A（5.0 min）；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5.0 μL，檢測時間5.0 min；檢測波長326 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備 吸取不同綠原酸標(biāo)準(zhǔn)母液0.5～6.0 mL用50%（體積比）甲醇-水溶液定容至10.0 mL棕色容量瓶中，配制不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。經(jīng)0.25 μm 微孔濾膜過濾后，按照設(shè)定條件進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.4 樣品溶液的制備 稱取0.2 g樣品，加40%甲醇-水溶液25.0 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min，再次稱定質(zhì)量，不足部分用40%甲醇補(bǔ)足。取小薊的甲醇提取液3.0 mL，過0.25 μm微孔濾膜，按照設(shè)定色譜條件進(jìn)樣5.0 μL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算小薊中綠原酸的含量。設(shè)3組平行。

1.3.5 方法評價 按“1.3.4”制備樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積和RSD，考察方法精密度；按“1.3.4”制備5份樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下，進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法重復(fù)性；按“1.3.4”制備樣品溶液，按“1.3.2”色譜條件下，分別于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h進(jìn)樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法穩(wěn)定性；稱取已測定綠原酸為2.15 mg/g的小薊樣品0.20 g，加入100.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液1 mL，同上法提取和分析，測定含量，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長確定

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的200～400 nm紫外吸收光譜圖見圖1。由圖1可知，綠原酸最大紫外吸收波長為327 nm，參考文獻(xiàn)[11，12]，本試驗采用327 nm作為檢測波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2。以綠原酸的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為y=316.20x-21.25，r=0.999 3，結(jié)果表明綠原酸在5.0～60.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 精密度 按上述方法分析計算峰面積的RSD為0.79%（n=5），表明在該條件下方法精密度良好（RSD<3%）。

2.3.2 重復(fù)性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.70%（n=5），表明在該條件下方法重復(fù)性良好（RSD<3%）。

2.3.3 穩(wěn)定性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.52%（n=5），表明在該條件下，綠原酸穩(wěn)定性較好（RSD<3%），從峰面積上看，綠原酸隨著時間延長，其含量會降低。

2.3.4 回收率 按上述方法測定綠原酸的加樣回收率，回收率結(jié)果見表1。

綠原酸回收率結(jié)果表明，平均回收率為101.0%，RSD為2.19%，滿足分析要求（RSD<3%）。

2.4 樣品測定結(jié)果

按照測定樣品溶液制備方法，平行制備樣品溶液3份，在上述條件下分析檢測，小薊中的綠原酸含量結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，樣品中的綠原酸含量為2.15 mg/g，平行測定的5組小薊中綠原酸含量差異不顯著。

3 討論

預(yù)試驗曾比較了體積比為10%～100%甲醇-水溶液提取效果，結(jié)果表明采用40%甲醇-水溶液提取樣品中的綠原酸峰面積最大，因此，選擇40%甲醇-水溶液為提取劑，后續(xù)試驗將重點圍繞提取劑條件中的超聲波功率、料液比、提取時間等因素展開。本試驗測定小薊中的綠原酸含量為2.15 mg/g，該結(jié)果與周建青等[8]，陳毓[9]，侯坤等[10]報道結(jié)果一致，但小于已報道的金銀花[11]和杜仲[13]中綠原酸含量。因此，綠原酸含量可能不能真實反映小薊品質(zhì)特征，后續(xù)研究可圍繞其他活性物質(zhì)開展分析[14， 15]。

另外，小薊在《中國藥典（2000版）》僅作了性狀和顯微描述，缺乏品質(zhì)控制標(biāo)準(zhǔn)和分析方法，而在藥典（2005版）中小薊品質(zhì)方面規(guī)定雖然有所增加，但相關(guān)檢測方法仍有不足，《藥典（2010版）》建立了小薊中有效成分含量檢測的通用方法。本試驗采用的UPLC法作為一種新型高效液相分析方法，具有精密度高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確可靠，簡便快速等特點，可為小薊中其他組分分析提供技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海科技出版社， 2005.

[2] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[3] 于生蘭，張 龍，孫 玲.金銀花的研究進(jìn)展[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2002，13（8）：498-500.

[4] 陳 毓， 丁安偉，楊星昊，等. 小薊化學(xué)成分藥理作用及臨床應(yīng)用研究述要[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（4）：614-615.

[5] 楊星昊， 崔敬浩，丁安偉.小薊提取物對凝血、出血及實驗性炎癥的影響[J]. 四川中醫(yī)，2006，24（1）：17.

[6] 魏 彥，邱乃英，歐陽青. 大薊、小薊的鑒別與臨床應(yīng)用[J]. 北京中醫(yī)雜志，2002，21（5）：296-297.

[7] 黃紹重. 綠原酸的提取及應(yīng)用[J]. 應(yīng)用化工，2006，35（6）： 467-469.

[8] 周建青， 徐愛列， 王國鋒. 不同測定方法測定小薊中綠原酸含量的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（27）：12902-12903.

[9] 陳 毓. RP-HPLC測定小薊中綠原酸的含量[J]. 中國現(xiàn)代中藥， 2007，9（9）：12-14.

[10] 侯 坤，許 浚，張鐵軍. HPLC同時測定小薊中蒙花苷和綠原酸的含量[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：62-64.

[11] 江 海，魏 巍，丁 銳.HPLC測定漢中地區(qū)金銀花中綠原酸含量[J]. 陜西理工學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，22（1）：87-90.

[12] 江 海. 陜西略陽杜仲葉中綠原酸的含量分析[J]. 光譜實驗室， 2012， 29（2）： 757-761.

[13] 周 蘭，熊慧林.RP-HPLC法測定杜仲葉中綠原酸的含量[J]. 首都醫(yī)藥，2009，16（6）：56.

[14] 曹 琴，陳建濤.小薊的化學(xué)成分研究[J].藥學(xué)實踐雜志， 2010，28（4）：271-274.

[15] 葸玉琴，梁孔賢，常河林，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取小薊中黃酮類化合物[J].西北師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2011，47（6）：63-70.endprint