響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇菌糠多糖提取工藝

張良等

摘要：為了優(yōu)化金針菇（Flammulina velutiper Sing）菌糠多糖的提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)提取時(shí)間、水料比、提取溫度進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面軟件Design-Expert進(jìn)行處理，得到金針菇菌糠多糖的最佳提取條件為：提取溫度95 ℃，水料比15∶1，提取4.26 h，此條件下提取的多糖含量為13.704 mg/mL，與預(yù)測(cè)值13.320 mg/mL十分接近，表明該模型可行。

關(guān)鍵詞：金針菇（Flammulina velutiper Sing）；菌糠；多糖；響應(yīng)面分析法

中圖分類(lèi)號(hào)：Q53；S646.1+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）16-3886-04

Abstract： Single-factor experiments and Box-Behnken central composite design were used to optimize the extraction of polysaccharides from waste materials of mushroom. The three factors and three levels including the extraction time， water-material ratio， extraction temperature of the experiment were designed. Response surface processing Design-Expert software was used. Results showed that optimal extraction conditions were temperature of 95 ℃， water-material ratio 15：1， time of 4.26 h. This condition could obtain 13.704 mg/mL polysaccharide， close to the predicting result of 13.320 mg/mL， proving that the model was feasible.

Key words：mushroom； waste material； polysaccharide； response surface analysis method

金針菇（Flammulina velutiper Sing）屬傘菌目白蘑科金針菇屬， 其味道清新淡雅，營(yíng)養(yǎng)豐富，是拌涼菜和火鍋的上好食材。從金針菇中提取的多糖具有增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫活性[1]的作用，可以抗腫瘤、抗白血病[2]，并且在體外有較好的抗氧化活性[3]。經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的金針菇多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌活性[4]。除此之外，動(dòng)物試驗(yàn)說(shuō)明對(duì)特定類(lèi)型的記憶障礙，其治療效果與腦復(fù)新相當(dāng)[5]。一些學(xué)者對(duì)真菌中提取的多糖做了大量研究，但是鮮見(jiàn)有從金針菇菌糠中提取多糖的報(bào)道[6-8]。

本試驗(yàn)主要研究提取溫度、水料比和提取時(shí)間對(duì)金針菇多糖提取量的影響，并且應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以獲得金針菇多糖提取的最佳條件，為大規(guī)模工業(yè)提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇菌糠；葡萄糖、濃硫酸、苯酚，以上皆為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱；分光光度計(jì)；水浴鍋；電子天平；高速離心機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理 將圓柱狀的金針菇菌糠掰碎至花生大小，然后放入鼓風(fēng)干燥箱中，在60 ℃的條件下烘干至恒重。粉碎，過(guò)20目篩存放至干燥處備用。

1.3.2 金針菇多糖提取及檢測(cè)過(guò)程 菌糠→不同條件下浸提→離心后取上清液→上清液稀釋20倍后取1 mL→加入0.5 mL 6%的苯酚試劑和2.5 mL的濃硫酸試劑→搖勻→靜置20 min→在490 nm的波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，以去離子水補(bǔ)至1.0 mL，然后加入6%苯酚0.5 mL及濃硫酸2.5 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min后于490 nm處測(cè)吸光度，以1.0 mL去離子水作為空白，橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1）提取時(shí)間。精確稱(chēng)取10 g金針菇菌糠于250 mL錐形瓶中，加入200 mL去離子水，搖勻至菌糠全部濕潤(rùn)，然后分別在95 ℃的條件下加熱1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，冷卻，于3 000 r/min的條件下離心5 min，取上清液，稀釋20倍后取1 mL，分別加入6%的苯酚0.5 mL及濃硫酸2.5 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min后在490 nm處測(cè)吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得多糖含量。

2）水料比。精確稱(chēng)取5 g金針菇菌糠，分別按照10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1的水料比（V/m，mL∶g，下同）加去離子水，搖勻至菌糠全部潤(rùn)濕，95 ℃水浴4 h，測(cè)多糖含量。

3）提取溫度。精確稱(chēng)取10 g金針菇菌糠于250 mL錐形瓶中，加入200 mL去離子水，搖勻至菌糠完全潤(rùn)濕，然后分別在65、70、75、80、85、90、95 ℃條件下水浴4 h，測(cè)多糖含量。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選取對(duì)多糖提取量有顯著影響的溫度、水料比、時(shí)間， 應(yīng)用三水平三因素的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)。因素與水平見(jiàn)表1。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響 由圖2可知，開(kāi)始時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的含量處于上升的趨勢(shì)，提取時(shí)間為3.5～4.0 h時(shí)，多糖含量達(dá)到最高。其后，隨著提取時(shí)間的增加，多糖含量由于水解作用反而降低，故提取時(shí)間選擇4.0 h。

2.1.2 水料比對(duì)多糖含量的影響 由圖3可知，隨著水比例的增加，多糖含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，勢(shì)，在水料比為15∶1時(shí)多糖含量達(dá)到最高，故選擇水料比為15∶1。

2.1.3 提取溫度對(duì)多糖含量的影響 由圖4可知，隨著提取溫度的升高，提取液中的多糖含量不斷上升，當(dāng)提取溫度升至85～95 ℃時(shí)，多糖含量上升幅度趨于平緩。但過(guò)高的溫度可以使水分蒸發(fā)過(guò)多，有可能使多糖水解導(dǎo)致含量下降，所以溫度不宜超過(guò)95 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)金針菇多糖的提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.1 各因素間的相互影響 采用相應(yīng)軟件Design-Expert進(jìn)行響應(yīng)面處理。將表2的試驗(yàn)結(jié)果輸入軟件后可以得到時(shí)間-水料比、時(shí)間-溫度、溫度-水料比的相互關(guān)系圖。

從圖2至圖4中可以看出，水料比是影響提取多糖含量的最大因素，時(shí)間和溫度對(duì)提取含量的的影響程度相近。

2.2.2 最佳條件確定 從Design-Expert軟件中可以得到回歸方程：R=118.625 20+26.671 02X1-1.356 82X2-3.374 60X3-0.082 830X1X2-0.036 813 X1X3-0.003 94X2X3-2.574 49X12+0.036 728X22+0.020 640X32，通過(guò)軟件求偏微分方程得到最佳條件為：提取時(shí)間4.26 h，溫度95 ℃，水料比15∶1。為驗(yàn)證用響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳提取條件是否可靠，采用以上試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，得到的產(chǎn)物中多糖含量為13.704 mg/mL，與預(yù)測(cè)值13.320 mg/mL十分接近，表明該模型可行。因此用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳提取條件具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)金針菇菌糠多糖提取溫度、水料比、時(shí)間三個(gè)條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并且針對(duì)這三個(gè)因素三水平的響應(yīng)面進(jìn)行分析，得到金針菇菌糠多糖的最佳提取工藝為：提取溫度95 ℃，提取時(shí)間4.26 h，提取水料比15∶1，此時(shí)多糖含量為13.704 mg/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王玉峰，王 旻，尹鴻萍.金針菇菌絲體中多糖的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及免疫學(xué)活性[J].中國(guó)天然藥物，2008，6（4）：312-315.

[2] 苗立成，王立強(qiáng)，吳 迪.金針菇多糖對(duì)小鼠抗腫瘤及抗白血病效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19（3）：171-173.

[3] 葉 敏.金針菇多糖的提取及清除羥自由基活性研究[J].畢節(jié)學(xué)院學(xué)報(bào)（綜合版），2011，29（4）：90-94.

[4] 劉 瑩，許 琳，趙 杰.金針菇多糖衍生物的制備及其抗菌性的測(cè)定[J].食品工業(yè)科技，2013，34（6）：137-139.

[5] 鄒 宇，廖森泰，吳娛明，等.金針菇多糖提取物對(duì)記憶障礙模型大鼠、小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2010（1）：26-30.

[6] 馬壽福，軍 花，刁治民，等.食用菌菌糠營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及利用途徑的研究[J].青海草業(yè)，2006，15（3）：36-40.

[7] 王永軍，田秀娥，李浩波.菌糠的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與開(kāi)發(fā)利用[J].中國(guó)飼料，2001（12）：30-31.

[8] 劉曉牧，王中華，李福昌，等.菌糠的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其應(yīng)用飼料與畜牧[J].飼料與畜牧，2000，8（6）：12-13.

（責(zé)任編輯 龍小玲）endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響 由圖2可知，開(kāi)始時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的含量處于上升的趨勢(shì)，提取時(shí)間為3.5～4.0 h時(shí)，多糖含量達(dá)到最高。其后，隨著提取時(shí)間的增加，多糖含量由于水解作用反而降低，故提取時(shí)間選擇4.0 h。

2.1.2 水料比對(duì)多糖含量的影響 由圖3可知，隨著水比例的增加，多糖含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，勢(shì)，在水料比為15∶1時(shí)多糖含量達(dá)到最高，故選擇水料比為15∶1。

2.1.3 提取溫度對(duì)多糖含量的影響 由圖4可知，隨著提取溫度的升高，提取液中的多糖含量不斷上升，當(dāng)提取溫度升至85～95 ℃時(shí)，多糖含量上升幅度趨于平緩。但過(guò)高的溫度可以使水分蒸發(fā)過(guò)多，有可能使多糖水解導(dǎo)致含量下降，所以溫度不宜超過(guò)95 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)金針菇多糖的提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.1 各因素間的相互影響 采用相應(yīng)軟件Design-Expert進(jìn)行響應(yīng)面處理。將表2的試驗(yàn)結(jié)果輸入軟件后可以得到時(shí)間-水料比、時(shí)間-溫度、溫度-水料比的相互關(guān)系圖。

從圖2至圖4中可以看出，水料比是影響提取多糖含量的最大因素，時(shí)間和溫度對(duì)提取含量的的影響程度相近。

2.2.2 最佳條件確定 從Design-Expert軟件中可以得到回歸方程：R=118.625 20+26.671 02X1-1.356 82X2-3.374 60X3-0.082 830X1X2-0.036 813 X1X3-0.003 94X2X3-2.574 49X12+0.036 728X22+0.020 640X32，通過(guò)軟件求偏微分方程得到最佳條件為：提取時(shí)間4.26 h，溫度95 ℃，水料比15∶1。為驗(yàn)證用響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳提取條件是否可靠，采用以上試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，得到的產(chǎn)物中多糖含量為13.704 mg/mL，與預(yù)測(cè)值13.320 mg/mL十分接近，表明該模型可行。因此用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳提取條件具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)金針菇菌糠多糖提取溫度、水料比、時(shí)間三個(gè)條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并且針對(duì)這三個(gè)因素三水平的響應(yīng)面進(jìn)行分析，得到金針菇菌糠多糖的最佳提取工藝為：提取溫度95 ℃，提取時(shí)間4.26 h，提取水料比15∶1，此時(shí)多糖含量為13.704 mg/mL。

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[8] 劉曉牧，王中華，李福昌，等.菌糠的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其應(yīng)用飼料與畜牧[J].飼料與畜牧，2000，8（6）：12-13.

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2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響 由圖2可知，開(kāi)始時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的含量處于上升的趨勢(shì)，提取時(shí)間為3.5～4.0 h時(shí)，多糖含量達(dá)到最高。其后，隨著提取時(shí)間的增加，多糖含量由于水解作用反而降低，故提取時(shí)間選擇4.0 h。

2.1.2 水料比對(duì)多糖含量的影響 由圖3可知，隨著水比例的增加，多糖含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，勢(shì)，在水料比為15∶1時(shí)多糖含量達(dá)到最高，故選擇水料比為15∶1。

2.1.3 提取溫度對(duì)多糖含量的影響 由圖4可知，隨著提取溫度的升高，提取液中的多糖含量不斷上升，當(dāng)提取溫度升至85～95 ℃時(shí)，多糖含量上升幅度趨于平緩。但過(guò)高的溫度可以使水分蒸發(fā)過(guò)多，有可能使多糖水解導(dǎo)致含量下降，所以溫度不宜超過(guò)95 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)金針菇多糖的提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.1 各因素間的相互影響 采用相應(yīng)軟件Design-Expert進(jìn)行響應(yīng)面處理。將表2的試驗(yàn)結(jié)果輸入軟件后可以得到時(shí)間-水料比、時(shí)間-溫度、溫度-水料比的相互關(guān)系圖。

從圖2至圖4中可以看出，水料比是影響提取多糖含量的最大因素，時(shí)間和溫度對(duì)提取含量的的影響程度相近。

2.2.2 最佳條件確定 從Design-Expert軟件中可以得到回歸方程：R=118.625 20+26.671 02X1-1.356 82X2-3.374 60X3-0.082 830X1X2-0.036 813 X1X3-0.003 94X2X3-2.574 49X12+0.036 728X22+0.020 640X32，通過(guò)軟件求偏微分方程得到最佳條件為：提取時(shí)間4.26 h，溫度95 ℃，水料比15∶1。為驗(yàn)證用響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳提取條件是否可靠，采用以上試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，得到的產(chǎn)物中多糖含量為13.704 mg/mL，與預(yù)測(cè)值13.320 mg/mL十分接近，表明該模型可行。因此用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳提取條件具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)金針菇菌糠多糖提取溫度、水料比、時(shí)間三個(gè)條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并且針對(duì)這三個(gè)因素三水平的響應(yīng)面進(jìn)行分析，得到金針菇菌糠多糖的最佳提取工藝為：提取溫度95 ℃，提取時(shí)間4.26 h，提取水料比15∶1，此時(shí)多糖含量為13.704 mg/mL。

參考文獻(xiàn)：

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