白癜風(fēng)患者淋巴細(xì)胞對自身抗原表位肽的免疫應(yīng)答研究

周福波，李 強(qiáng)，強(qiáng)慧妮，崔婷婷，郭 森，楊鈺琪，李春英，高天文

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性疾病，病因復(fù)雜。黑素細(xì)胞的殺傷、脫失是白癜風(fēng)發(fā)病的效應(yīng)環(huán)節(jié)，而CD8+T淋巴細(xì)胞對黑素細(xì)胞的殺傷作用已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，在白癜風(fēng)發(fā)病中，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞特異性識別的自身抗原主要來源于tyrosinase，gp100，Melan A/MART-1 等[3,4]。在對高加索人的研究中已經(jīng)確定的白癜風(fēng)抗原表位主要有以下幾條HLA-A*0201限制性的短肽：tyrosinase369-377，3D、gp100 209-217，2M、gp100 280-288，9V、Melan A/MART-1 26-35，2L 以及 Melan A/MART-1 26-35[5,6]。但高加索人、印度人、中國漢族人等不同人種的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子易感基因位點(diǎn)可能存在明顯差異[7]。本研究的目的是對漢族進(jìn)展期白癜風(fēng)患者針對上述已知表位肽段的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況進(jìn)行研究，明確其在漢族人白癜風(fēng)發(fā)病中所起的作用，并通過對治療前后免疫應(yīng)答水平的比較，進(jìn)一步明確與病情的活動和轉(zhuǎn)歸有無關(guān)聯(lián)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

102例研究對象均為我科門診就診的進(jìn)展期白癜風(fēng)患者，符合白癜風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，病程在3個月內(nèi)且病情快速進(jìn)展，色素脫失范圍大于體表面積5%，2個月內(nèi)未行任何治療。其中男45例，女57例，年齡6～54歲，平均年齡（27.6±10.7）歲，病程20～87 d，平均46 d。所有患者抽取10 ml全血進(jìn)行檢測，HLA-A*0201患者治療1個月、3個月后復(fù)診時再次抽血檢測。

1.2 抗原表位肽段的合成

根據(jù)先前文獻(xiàn)中已經(jīng)報道的肽段[1,3-6]，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成以下HLA*0201限制性短肽：tyrosinase369-377，3D ：YMDGTMSQV，gp100 209-217，2M: IMDQVPFSV，gp100 280-288，9V：YLEPGPVTV，MART-1 26-35，2L：ELAGIGILTV，MART-1 26-35：EAAGIGILTV，陽性對照肽段 flu 58-66：GILGFVFTL，以及無關(guān)肽段HIV p17Gag：SLYNTVATL。

1.3 方法

1.3.1 外周血單個核細(xì)胞（PBMC）分離 利用Ficoll密度梯度離心法進(jìn)行外周血PBMC分離：將10 ml外周血與10 ml PBS混勻后逐滴滴入10 ml淋巴細(xì)胞分離液中，2 000 r/min離心20 min。吸出白膜層，用PBS稀釋，混勻，1 000 r/min離心10 min。倒去上清，再次洗滌，細(xì)胞沉淀即為外周血PBMC。

1.3.2 DNA提取 利用北京TIANGEN基因組DNA提取試劑盒對所有患者提取外周血DNA后送至深圳華大臨床檢驗(yàn)中心有限公司基因行HLA-A位點(diǎn)分型檢測。

1.3.3 ELISPOT實(shí)驗(yàn) γ-干擾素 (IFN-γ) ELISPOT試劑盒購自瑞典MABTECH AB公司。無菌PBS清洗孔板后每孔加入200 l易得培養(yǎng)基室溫封閉30 min。去除培養(yǎng)基，每孔加入2×105個PBMC，依次加入上述白癜風(fēng)相關(guān)肽段(終濃度為10 g/ml)，同時設(shè)置陽性刺激孔(CD3 1:1 000) 、無關(guān)對照孔(HIV p17Gag SLYNTVATL)，每個患者設(shè)置3組重復(fù)。37℃，5%CO2恒溫孵箱孵育36 h后棄細(xì)胞懸液，無菌PBS清洗5次。將7-B6-ALP鏈霉親和素按照1:200稀釋于含0.5%胎牛血清的PBS后每孔添加100 l室溫孵育2 h。清洗孔板，每孔添加100 l BCIP/NBT底物液后常溫避光放置，孔板顯清晰斑點(diǎn)后即沖洗。晾干后利用讀板儀計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。每2×105個PBMC中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)目（SFC）為：孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)-同一患者無關(guān)肽段孔的斑點(diǎn)數(shù)。每孔的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)目即為2×105個PBMC中可以特異性識別肽段的T細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及制圖。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-A位點(diǎn)分型

HLA-A為等位基因，102例進(jìn)展期白癜風(fēng)患者HLA-A位點(diǎn)分型結(jié)果及不同HLA-A位點(diǎn)限制性患者數(shù)見表1。 HLA-A*0201限制性患者占總例數(shù)的38.24%（39/102），非HLA-A*0201限制性患者占61.76%（63/102）。

表1 102例進(jìn)展期白癜風(fēng)患者HLA-A位點(diǎn)分型

2.2 ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HLA-A*0201限制性患者與非HLA-A*0201限制性患者ELISPOT結(jié)果見圖1。與非HLA-A*0201限制性患者相比，HLA-A*0201限制性患者對白癜風(fēng)表位肽段、流感病毒肽段有較強(qiáng)的反應(yīng)。

2.3 2例HLA-A*0201患者治療前后細(xì)胞免疫水平

選取2例患者行窄譜中波紫外線（NB-UVB）照射、局部外用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（他克莫司）治療后明顯緩解的HLA-A*0201患者追蹤其細(xì)胞免疫應(yīng)答變化，結(jié)果見表2。

第27號患者經(jīng)過1個月的治療后，針對2號、5號肽段的細(xì)胞免疫水平有所上升，而針對其他肽段的細(xì)胞免疫水平下降。經(jīng)過3個月的治療后，針對所有肽段的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平均有所下降。

圖1 不同HLA-A分型的白癜風(fēng)患者ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

第43號患者在經(jīng)過1個月、3個月的治療后，針對每一條白癜風(fēng)相關(guān)肽段的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平均有所下降。

表2 2例HLA-A*0201患者治療后細(xì)胞免疫水平變化

3 討論

白癜風(fēng)患者發(fā)病時自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞對黑素細(xì)胞的破壞已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)。而作為自身免疫反應(yīng)的始動環(huán)節(jié)——自身抗原的識別，一直是白癜風(fēng)自身免疫機(jī)制研究的熱點(diǎn)。從1998年開始，相繼有研究證實(shí)，在白癜風(fēng)的發(fā)病中，患者的外周血PBMC可以特異性識別黑素細(xì)胞分化抗原，主要為tyrosinase、gp100、Melan A/MART-1[3-6,9]。但由于在不同的研究中患者人種、地區(qū)、疾病進(jìn)展情況、HLA-A位點(diǎn)的不同，其得出的結(jié)論不完全一致。尤其是tyrosinase、Melan A/MART-1，對于其是否能夠在白癜風(fēng)發(fā)病中發(fā)揮自身抗原作用，目前結(jié)論尚不一致[3,5]。

近年來的高通量基因組學(xué)研究——GWAS研究證實(shí)，白癜風(fēng)發(fā)病中同一分子的易感位點(diǎn)在不同的人群中存在著一定程度的差異。Birlea等[10]發(fā)現(xiàn)在高加索人群中，白癜風(fēng)易感的基因位點(diǎn)主要位于MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ類分子上。而漢族人的白癜風(fēng)易感位點(diǎn)與之不同[11]。考慮到不同的MHC分子對抗原肽的提呈不同，且目前尚不明確在高加索人白癜風(fēng)患者的抗原表位肽段是否也為漢族白癜風(fēng)人群的抗原表位。我們選取進(jìn)展期白癜風(fēng)患者進(jìn)行細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究，以便更加客觀地反映白癜風(fēng)患者急性發(fā)病時的細(xì)胞免疫狀況。

HLA分型方面，HLA-A*0201限制性患者所占比例最大（38.24%），其次為HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*3001、HLA-A*0301、HLA-A*0206等，這與之前在漢族人群中進(jìn)行的HLA-A易感位點(diǎn)分析是一致的[12,13]。通過利用5條不同的肽段刺激白癜風(fēng)患者外周血PBMC，我們發(fā)現(xiàn)HLA-A*0201限制性患者對這5條肽段有著較高的應(yīng)答反應(yīng)，而非HLA-A*0201限制性的患者則對這些肽段反應(yīng)較弱。說明已知的高加索人白癜風(fēng)自身抗原肽段也能夠被漢族易感人群的免疫細(xì)胞特異性識別，進(jìn)而在白癜風(fēng)的發(fā)病中發(fā)揮作用。而2例患者針對gp100 280-288，9V肽段特異性反應(yīng)水平最高，這說明白癜風(fēng)患者針對gp100有著較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這與之前相關(guān)報道結(jié)果一致[3]。對2例患者治療前后不同時間段細(xì)胞免疫水平進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)患者針對不同肽段的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平隨著病情的好轉(zhuǎn)有所下降，提示患者的病情變化與細(xì)胞免疫應(yīng)答水平存在著一定程度的關(guān)聯(lián)。有研究對18例進(jìn)展期白癜風(fēng)與6例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者細(xì)胞免疫功能進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)患者PBMC僅對gp100的識別在兩組之間有所差異，進(jìn)而得出僅gp100肽段的反應(yīng)與疾病進(jìn)展程度相關(guān)[3]。鑒于我們僅觀察了2例患者治療前后的變化，尚需要對更多患者的細(xì)胞免疫狀況進(jìn)行比較，方能得出更加客觀的結(jié)論。

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