梅毒螺旋體基因重組抗原及其血清學診斷研究進展

莫顯文

導致人體感染梅毒的致病菌為蒼白螺旋體的亞種-密螺旋體（TP），感染人體的主要致病菌株為Nichols株。梅毒螺旋體的細胞質(zhì)被3層細胞質(zhì)外膜包裹著，而暴露于外膜的跨膜蛋白數(shù)量較少，但跨膜蛋白在臨床中對于梅毒的診斷確診有著極大的實際價值[1]。在實際的臨床操作中，很難對梅毒螺旋體進行體外培養(yǎng)，確診梅毒的方式由培養(yǎng)梅毒螺旋體替代為利用梅毒螺旋體的重組抗原進行對應的檢測。

1 梅毒螺旋體基因重組抗原的研究進展

1.1 Tpr基因家族 Tpr基因家族涵蓋了12個蛋白，這12個蛋白按照同源性氨基酸的分類應該屬于3個不同的亞型，其中Ⅰ亞型為Tpr C、D、F、I，Ⅱ亞型為Tpr E、G、J，Ⅲ亞型為 A、B、H、L、K[2]。在這 3 個亞型中，在梅毒感染兔的模型中，誘導T細胞以及強烈的抗體反應的為Tpr K，這一實驗結(jié)果提示著使用Tpr免疫能夠有效地減弱梅毒患者損傷后病情的進一步發(fā)展。在分子結(jié)構(gòu)學上，對于Tpr家族的Ⅰ亞型而言，其中它們的C端和N端高度相似于F端和N端，特別是在Tpr的C、D兩個亞型之間，它們C端結(jié)構(gòu)的相似度高達94%[3]。在對Tpr家族的抗原氨基末端的重組性實驗中發(fā)現(xiàn)，這些抗原對于感染梅毒患者的損傷的進展有著一定程度的減弱作用，這些重組抗原很可能起著關(guān)鍵作用的階段為梅毒患者的不完全免疫階段。

1.2 TpN15、TpN47、TpN17、TmpA 1989 年 有 學者利用兔子的抗體血清成功的篩查出了Tp基因組中的6個重組克隆，且利用Western法以及電泳法成功的篩選出了TpN15、TmpA、TpN17等3個蛋白[4]。在1996年，相應的學者在通過對梅毒螺旋體的結(jié)構(gòu)的進一步研究中發(fā)現(xiàn)，他們利用PCR法對梅毒螺旋體內(nèi)的基因進行了擴增，并將擴增后的基因插入大腸桿菌內(nèi)進行了表達，結(jié)果獲得了TpN47、TpN35、TpN44.5、TpN29-35、TpN39等抗原，接下來的ELISA法實驗中發(fā)現(xiàn)上述抗原中引起抗體滴度最高的為TpN47、TpN17、TpN44.5[5]。在后續(xù)的相關(guān)實驗中，學者重組并成功表達了TpN47的載體pGEX-2T，并成功證實了其具有免疫原性，同時有學者的相關(guān)實驗還成功的證實了TpN47是一種能夠與青霉素進行結(jié)合的蛋白，并且發(fā)現(xiàn)TpN47與青霉素結(jié)合的位點有3個，同時還證實TpN47本身是一種具有鋅依賴性的羧肽。有學者通過重疊多肽的方法成功的找出了位于TpN47上的抗原表位[6]。

1.3 TROMP TROMP對于梅毒具有免疫原性，而在TROMPs的表面可能存在著免疫宿主的介導區(qū)和致病力決定區(qū)，在TROMP的表面上存在著17-kDa、28-kDa、31-kDa、45-kDa、65-kDa。其中存在于TP內(nèi)膜原生質(zhì)體復合物中的主要為17-kDa和45-kDa，而存在于外膜的主要為28-kDa、31-KDa以及65-kDa[7]。在天然重組蛋白質(zhì)中，28-kDa、31-kDa、65-kDa就天然的具有抗原性質(zhì)，28-kDa主要在外膜中進行表達，并且與跨膜蛋白存在著高度相似的序列，65-kDa其整體數(shù)量雖然較少，但是仍然被認定為具有抗原免疫性，而31-kDa被證明具有能夠形成微管的能力，從而被間接的證實為跨膜蛋白。目前國外的相應研究已經(jīng)明確，TP分子本身的免疫反應能夠產(chǎn)生高滴度的TP抗體，在上述反應過程中，TROMPs能夠誘導產(chǎn)生對應的抗體。在相關(guān)的實驗中發(fā)現(xiàn)，只有自然的TP感染才能夠產(chǎn)生真正的血清吞噬作用，而使用滅活的Tp重組抗原并不能夠產(chǎn)生真正意義上的血清吞噬作用[8]。在對TROMP1的各項重組實驗中可以發(fā)現(xiàn)，在電子顯微鏡下可以明顯發(fā)現(xiàn)在Tp感染的血清中，TROMP1的表達主要是在重組菌的表面表達，相應的實驗還證實對于rTROMP1而言，其定位于E.coil的外膜，并且同時兼有表面抗原性以及微孔體系。

1.4 Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453、Tp92 在1998年的實驗中，有學者發(fā)現(xiàn)對于Tp92而言，其極有可能是Tp的抗原之一，并通過PET-3a T7載體重組表達了Tp92，通過對表達后的Tp92進行相應的檢測發(fā)現(xiàn)，Tp92確實具有抗原免疫性[9]。Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453都是通過PCR擴增法進行了去除N端信號肽的全長表達，且表達后的這6個蛋白均進行了臨床血清學的檢測，最后的實驗結(jié)果顯示，對于Tp0155、Tp0751、Tp0483而言，實驗的靈敏度為28%~42%之間，而對于Tp0453而言，其中檢測的靈敏度和特異度均為100%，Tp92的特異度為97%、靈敏度為98%。其中學者描述了Tp0453的除去兩段端肽的結(jié)構(gòu)，但近些年來的實驗研究則顯示，Tp0453的結(jié)構(gòu)目前與所有已知的外膜蛋白都不相同，Tp0453缺少一種β桶結(jié)構(gòu)，正是因為缺少這種結(jié)構(gòu)，導致Tp0453無法橫跨外膜，從而避免暴露于Tp的菌體外膜表面[10]。正是因為Tp0453的這種結(jié)構(gòu)特殊性，有學者認為對于Tp0453極有可能代表一大類的新的細菌外膜蛋白。國內(nèi)有學者新組了Tp0453并對其進行了臨床評價，最后的實驗結(jié)果顯示，Tp0453應該可以被用于ELISA反應[11]。

1.5 Tp4D以及TpN37 在1986年的國外學者的相應實驗中就已經(jīng)證實，對于Tp4D而言，其確實具有抗原免疫性，同時相應的ELISA法也證實，4D的ELISA能夠檢測到的抗4D特異性抗體為25 ng，且在檢測的靈敏度上可以與免疫熒光法相媲美，但是Tp4D的一個重大缺陷就是存在著與地方性梅毒菌種的一個交叉反應[12]。同樣在1986年，國外學者使用5.6 kb的TpDNA的重組基因的質(zhì)粒做出內(nèi)切酶圖譜后，再成功地轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進行了表達。利用免疫雜交點的方法對TpN37進行檢測時發(fā)現(xiàn)，對于梅毒二期的血清檢測有效，如果改變檢測的方法，利用放免和酶免的方法進行相應的檢驗，TpN37與所有血清中的抗體都能夠發(fā)生反應，但唯一的不足是對于陰性對照則沒有反應表現(xiàn)出。在兔梅毒模型中，利用兔子血清制作的特異性兔單克隆抗體能夠有效地被TpN37抗原，并且TpN37抗原不會與其他的非致病性的螺旋體發(fā)生反應，上述實驗結(jié)果提示對于TpN37而言，其能夠有效的作為血清診斷梅毒的有效抗原[13]。

2 梅毒螺旋體基因重組抗原血清學診斷的研究進展

有相應的臨床大樣本量的實驗研究證實，Tp凝血實驗的最終結(jié)果與利用Tp基因重組抗原的臨床快速檢測在檢測的靈敏度上無顯著統(tǒng)計學差異。但Tp單一基因重組抗原對于合并了HIV感染，或者是已經(jīng)接受了一段時間的抗梅毒治療的患者，或者是處于潛伏期的梅毒患者而言，其檢測的靈敏度會大大下降，而如果使用多基因重組的Tp重組基因抗原，則其檢測的整體靈敏度將會大大提高，出現(xiàn)的假陰性的比例會大大減小[14]。

2.1 免疫層析實驗的研究進展 利用Tp基因重組的抗原包被膜條測試區(qū)時，當抗原中的IgG/IgM與膜條測試區(qū)域中的標記的抗人IgG/IgM結(jié)合后，結(jié)合后的復合物最終層析到膜條測試區(qū)與特異抗原結(jié)合后所呈現(xiàn)出來的顯色標記就為陽性反應標記[15]。在TPHA的評價標準下，有學者將4種不同國家生產(chǎn)的免疫層析試劑盒用來進行評價，結(jié)果這4個國家的免疫層析試劑盒的最終檢測結(jié)果顯示，不論是在全血還是在血清檢測的敏感性上，都取得了良好的結(jié)果，上述的實驗結(jié)果讓人相信在不遠的將來，免疫層析實驗將有可能取代傳統(tǒng)的篩查實驗。

2.2 Tp-ELISA的研究進展 在目前的Tp-ELISA研究中，聚苯乙烯反應板微孔在被Tp重組基因抗原包被，且抗人IgG/IgM在被酶標記的情況下，可以有效的對Tp的IgG/IgM進行檢測。在雙抗原夾心的ELISA法中，酶和反應板均對Tp重組的酶抗原進行了標記。在利用Tp的3種組合表達蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的ELISA檢測實驗與性病研究實驗、熒光密螺旋體抗體吸收試驗以及TPHA實驗的檢測靈敏度、特異度相比，利用Tp的3種組合表達蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的 ELISA檢 測 實 驗 的對處于不同分期的梅毒患者的檢測的靈敏度、特異度均要顯著高于其他3種方法。而國外學者在利用重組的TpN17-15-ELSIA法與WB、以及THBA法相比，在對正常人和含有疾病的2950份血清的檢測中，TpN17-15-ELSIA法與WB法均未出現(xiàn)交叉反應，而THBA法則出現(xiàn)了交叉反應[16]。而在對Tp多基因嵌合重組抗原與Tp單基因重組抗原的平行檢測中發(fā)現(xiàn)，Tp多基因嵌合重組抗原檢測的靈敏性要顯著高于Tp單基因重組抗原，在對雙抗原夾心ELISA法與間接ELISA法的比較中，雙抗原夾心ELISA法的檢測準確性要顯著優(yōu)于間接ELISA法。而目前在投入商業(yè)化使用的Tp重組基因的ELSIA法檢測試劑盒中，其檢測的靈敏度和特異度均為100%。

2.3 快速乳膠凝集試驗 在實驗的原理上，快速乳膠凝集試驗的基本原理與Tp的顆粒凝集試驗相似。在臨床實驗中，有學者利用TpN15、TpN17、TpN47作做為抗原，利用快速乳膠凝集試驗法快速檢測了1518份隨機得來的血清樣本，將檢測的實驗結(jié)果同VDRL法的特異度進行檢測，并同時期檢測99分梅毒血清樣本，最后的實驗結(jié)果顯示，快速乳膠凝集試驗與VDRL法檢測的特異度并無顯著的統(tǒng)計學差異[17]。上述的實驗結(jié)果提示，在梅毒的篩查中可以考慮使用快速乳膠凝集試驗。

2.4 CLIA法 CLIA法的中文名稱為化學發(fā)光免疫分析，其基本原理為將固相抗原設(shè)定為Tp基因重組抗原，利用HRP對第二抗原進行標記，同時使用含魯米諾或者是其對應的增強劑作為示蹤劑，通過最后測量其發(fā)光數(shù)值的方法來進行檢測。我國學者通過使用TpN15、TpN17、TpN47作為對應的酶標抗原和固相抗原，成功的建立了基于Tp為雙抗原夾心的CLIA法，通過與TRUST、TPPA、TPHA、Tp-ELISA法 平 行 的 檢 測 Tp抗體檢測分別呈陽性和陰性的血清，結(jié)果最后的實驗結(jié)果顯示這4種方法的陽性檢測率和陰性檢測率均無顯著的統(tǒng)計學差異[18]。

2.5 WB法 將Tp的重組基因抗原通過SDS-PAGE通過電印轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，再與待檢測的血清進行檢測后通過酶標記抗人的IgG/IgM。其實驗的基本原理為，如果待檢測的血清中存在TpN15、TpN17、TpN42、 TpN47、TpN37等抗體，則加酶的底物可以出現(xiàn)反應，并且能夠顯色。有國外學者將rpN47、rTpNl7、rTpNl5、rTpN42、rTpN37這5種多肽進行重組建立recWB法，并與MHA-Tp以及wclWB對比進行梅毒血清的檢測，相應的實驗結(jié)果顯示，在各項綜合指標的評價中，recWB法要顯著優(yōu)于wclWB法[19]。

目前部分Tp重組基因的抗原已經(jīng)應用于臨床梅毒的檢測中，其中涉及的Tp基因重組的抗原主要為TpN15、TpN17、TpN47，在初期使用的Tp基因重組抗原多為單一基因的抗原，現(xiàn)在則多為多基因嵌合的抗原，雖然對于各期梅毒的檢查靈敏度和特異度得到了極大的提高，但是仍然存在著較大的不足，且在實際中對于何種Tp抗原的檢測結(jié)果更為準確，仍然存在著較大的爭議[20]。目前隨著免疫學技術(shù)的不斷進步與發(fā)展，已經(jīng)逐步能夠解決難以從Tp中純化的微量蛋白數(shù)量問題，并已經(jīng)能夠?qū)ζ渚唧w的作用機制展開相應的研究。這也意味著，Tp基因重組抗原應用于梅毒的檢測中的前景更為廣闊。

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