LC-MS在中藥指紋圖譜研究中的應(yīng)用

朱振興，楊瑞芳

(1.鄭州市中醫(yī)院，鄭州 450052;2.河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，鄭州 450000）

高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(high performance liquid chromatogrphy-mass spectrometry，LC-MS）將二者的優(yōu)勢進行了結(jié)合，即高效液相進行分離，質(zhì)譜進行檢測，即使復(fù)雜的混合物也能被HPLC分離，而質(zhì)譜則能提供高靈敏度的檢測，從而獲得化合物的結(jié)構(gòu)信息。二者的聯(lián)用能夠發(fā)揮各自的最大優(yōu)勢和避免彼此的短處，從而獲得兩種儀器單獨使用時所不具備的功能［1］。中藥材指紋圖譜系指中藥材經(jīng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示該中藥材特性的共有峰的圖譜［2］。指紋圖譜和中醫(yī)的思維方式相似即一種整體性和模糊性的思維方式，和傳統(tǒng)的中藥質(zhì)量控制模式比較其更有優(yōu)勢，既強調(diào)不同種中藥的差異性又突出同種中藥的相似性。中藥指紋圖譜可以整體的、宏觀的和可以量化的信息［3］，中藥指紋圖譜的建立可以采用多種分析方法，而現(xiàn)代分析方法的發(fā)展剛好滿足了這一要求［4］。該文就LC-MS在中藥指紋圖譜研究的應(yīng)用做一綜述。

1 LC-MS發(fā)展概況

LC-MS聯(lián)用技術(shù)在20世紀(jì)70年代開始研制，至今已有40多年的發(fā)展史，已經(jīng)發(fā)展為一種成熟、常規(guī)的分離分析方法，在醫(yī)藥、生物、化工、農(nóng)業(yè)、環(huán)境各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［1］。

LC-MS儀的分類:根據(jù)質(zhì)譜(mass spectrometry，MS）離子源(接口）和質(zhì)量分析器的不同可以將LCMS儀分為不同的類型。按離子源分類:熱噴霧離子源、大氣壓化學(xué)電離源、電噴霧離子源等。按質(zhì)量分析器分類:液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀，液相色譜-離子阱質(zhì)譜儀，液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀，以及液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，如三重四級桿質(zhì)譜儀，四級桿飛行時間質(zhì)譜儀等。

1.2 LC-MS聯(lián)用儀的組成 LC-MS聯(lián)用儀主要由高效液相色譜，接口裝置(同時也是電離源），質(zhì)譜儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。高效液相部分與一般的液相色譜相同。

LC-MS聯(lián)用的關(guān)鍵是二者之間的接口裝置，由于LC和MS工作狀態(tài)的差異較大，二者的匹配較氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）難度更大。接口裝置的主要作用是去除溶劑并使樣品離子化。LC-MS自從研制以來出現(xiàn)過多種接口裝置如傳送帶接口、熱噴霧接口、粒子束接口、快原子轟擊接口等［1］。20世紀(jì)80年代，大氣壓電離源用作LC-MS聯(lián)用儀的接口裝置和電離裝置后，使LC-MS聯(lián)用技術(shù)提高了一大步。目前，幾乎所有的LC-MS聯(lián)用儀都使用大氣壓電離源作為接口裝置和離子源。大氣壓電離源(atmospheric pressure ionization，API）包括電噴霧離子源(electrospray ior source，ESI）和大氣壓化學(xué)離子源(atmospheric pressure chemicl ionization，APCI）兩種，二者之中電噴霧源應(yīng)用最廣。

1.3 常用離子源(接口）簡介 LC-MS聯(lián)用出現(xiàn)的各種接口裝置中以ESI應(yīng)用最為廣泛，其工作原理(見圖1）為:溶劑由液相泵輸送到金屬毛細(xì)管噴嘴，毛細(xì)管加有2～4 kv的高壓，由于高壓和霧化氣的作用，流動相從毛細(xì)管頂端流出時，會形成扇狀噴霧。電噴霧離子化可分為3個過程:①形成帶電小液滴:由于毛細(xì)管被加高壓，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，形成帶電液滴。②溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂:溶劑蒸發(fā)，離子向液滴表面移動，液滴表面的離子密度越來越大，當(dāng)達(dá)到Rayleigh(瑞利）極限時，即液滴表面電荷產(chǎn)生的庫侖排斥力于液滴表面的張力大致相等時，液滴會非均勻破裂，分裂成更小的液滴，在質(zhì)量和電荷重新分配后，更小的液滴進入穩(wěn)定態(tài)，然后再重復(fù)蒸發(fā)、電荷過剩和液滴分裂這一系列過程。③形成氣相離子:對于半徑＜10 nm的液滴，液滴表面形成的電場足夠強，電荷的排斥作用最終導(dǎo)致部分離子從液滴表面蒸發(fā)出來，而不是液滴的分裂，最終樣品以單電荷或多電荷離子的形式從溶液中轉(zhuǎn)移至氣相，形成了氣相離子。在大氣壓條件下形成的離子在強電位差的驅(qū)動下，經(jīng)取樣孔進入質(zhì)譜真空區(qū)。

圖1 ESI電離源工作原理示意圖

離子源(liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometev，LC-ESI-MS）譜圖主要給出準(zhǔn)分子離子的相關(guān)信息以及大量的多電荷離子，而較少出現(xiàn)碎片離子。LC-ESI-MS常用于強極性、熱不穩(wěn)定化合物及高分子化合物的檢測。但ESI源對流量有一定的限制，即流量不能太大［1］。

APCI電離是在大氣壓條件下利用尖端高壓(電暈）放電促使溶劑和其他反應(yīng)物電離、碰撞，及電荷轉(zhuǎn)移等方式，形成一個反應(yīng)氣等離子區(qū)，樣品分子通過等離子區(qū)時，發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，形成了(M+H）+或(M-H）-離子或加和離子。一般ESI源加一個電暈放電針即APCI源。

APCI也是一種軟電離技術(shù)，與ESI相比適于極性較小的化合物。

2 LC-MS在中藥指紋圖譜研究的應(yīng)用

中藥的現(xiàn)代研究雖然取得了很大的進展，但大多數(shù)中藥的有效成分依然沒有探明，作用機制更無從談起，顯然現(xiàn)行的靠單一指標(biāo)評價中藥的質(zhì)量是片面的［5］。而高效液相色譜-二極管陣列檢測器-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用方式(HPLC-DAD-MS-MS）可以得到多維多息指紋圖譜。所謂多維，即采用多種分析儀器聯(lián)用模式。所謂多息，即特征譜應(yīng)努力做到包括化學(xué)和藥效兩方面的信息。HPLC-DAD-MS-MS可以滿足這方面的需求，液質(zhì)聯(lián)用指紋圖譜可以提供中藥藥效和質(zhì)量關(guān)系的信息，且較其他的分析手段更加系統(tǒng)全面［4］。

王源園等［6］采用HPLC-UV-MS法對牛膝藥材的指紋圖譜進行研究，得到分離度、重現(xiàn)性均較好的牛膝藥材HPLC-UV指紋圖譜，并借助HPLC-MS技術(shù)對其主要色譜峰進行了初步歸屬，從而為牛膝的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。張尊建等［7］采用HPLC-UVMS法對忍冬和山銀花藥材進行指紋圖譜研究得到分離度和重復(fù)性均較好的忍冬和山銀花藥材HPLC-UV及HPLC-MS指紋圖譜，分別對忍冬指紋圖譜中8個色譜峰和山銀花圖譜中5個色譜峰進行了初步定性，并比較兩種藥材指紋圖譜的差異。余靜等［8］采用 HPLC-UV-MS法分別對刺五加藥材水溶性和脂溶性成分進行指紋圖譜研究，得到分離度和重現(xiàn)性均較好的刺五加藥材HPLC-UV及HPLCMS指紋圖譜，并分別對水溶性成分指紋圖譜中5個色譜峰和脂溶性成分指紋圖譜中8個色譜峰進行了初步定性，從而為刺五加藥材及其制劑的鑒別提供更加全面、可靠的依據(jù)。韓鳳梅等［9］采用高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜 (HPLC-ESI-MS）研究山麥冬甲醇提取物的指紋圖譜，其中山麥冬甲醇提取物色譜圖中有17個共有峰的重現(xiàn)性與精密度的RSD＜5%，HPLC-ESI-MS技術(shù)建立的山麥冬指紋圖譜特征性強、重現(xiàn)性較好，可用于山麥冬的品質(zhì)評價與品種鑒別。張尊建等［10］采用HPLC-UVMS對脈絡(luò)寧注射液(石斛、牛膝、玄參和金銀花）的指紋圖譜進行研究，以綠原酸為參照峰，標(biāo)示出脈絡(luò)寧注射液10個共有峰，說明了其藥材歸屬，并采用HPLC-MS對主要色譜峰進行了初步定性，該方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為脈絡(luò)寧注射液的指紋圖譜質(zhì)量控制提供了依據(jù)。趙新峰等［11］建立了LC-ESI-MS定性分析六味地黃丸的方法，通過2級質(zhì)譜識別了其中的9種化學(xué)成分，結(jié)果表明，六味地黃丸的總離子流色譜圖比紫外色譜圖具有更強的特征性，以質(zhì)譜作為檢測器是一種很好的研究中藥指紋圖譜的方法。劉思明等［12］采用高效液相電噴霧離子阱質(zhì)譜對巖黃連注射液的指紋圖譜進行研究，對其中的11種主要成分進行了指認(rèn)，LC-UV對其中的2種成分進行了定量評價，所建指紋圖譜能體現(xiàn)巖黃連注射液的特點，相似度評價和方法學(xué)考察結(jié)果良好，可用于巖黃連的質(zhì)量控制及定量測定。戴德舜等［13］采用HPLC-MS的方法對桂枝湯A部分的雙向調(diào)節(jié)樣品與單向升溫樣品進行了指紋圖譜研究，通過鎖定色譜峰中主要分子量的方法對照了桂枝湯A部分兩份不同藥效樣品，通過指紋圖譜與MS離子流圖相結(jié)合的方式分析了產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，確認(rèn)了樣品中所含物質(zhì)成分在量上的差異。晏媛等［14］采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對蒲公英灌腸液色譜圖譜進行研究，通過質(zhì)譜的質(zhì)荷比M/Z及色譜保留時間的相互比較確定了咖啡酸、阿魏酸和原兒茶醛3種活性成分。王穎等［15］采用LC-MS技術(shù)測定了中藥三七(包括藥材、中間體及針劑成品）的指紋圖譜。對中間體和成品則直接進樣分析，并比較了三者的相關(guān)性。

綜上所述，LC-MS主要用于中藥的質(zhì)量控制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究，無論在藥材還是制劑研究都得到了較廣的應(yīng)用。它彌補了傳統(tǒng)方法定性鑒別、確定結(jié)構(gòu)能力有限的缺點，解決了傳統(tǒng)液相檢測器靈敏度和選擇性不夠的缺點，可以提供可靠、精確的相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息，必將成為研究中藥復(fù)雜物質(zhì)體系的有力手段。

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