參靈方對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜損傷的保護(hù)機(jī)制研究

趙存方 張 竟 于榮屏

(中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院干部病房，河北 石家莊 050082)

1 中國(guó)人民解放軍北京軍區(qū)聯(lián)勤部石家莊第二離職工部休養(yǎng)所，河北 石家莊 050000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)炎癥性自身免疫性疾病［1］，目前尚無(wú)特效治療藥物。RA可侵襲患者消化系統(tǒng)，且治療藥物也?？稍斐晌改c黏膜的損傷，使患者消化系統(tǒng)癥狀更加明顯，是影響RA患者長(zhǎng)期治療的關(guān)鍵問(wèn)題之一。本實(shí)驗(yàn)研究擬通過(guò)建立佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型，然后在給予參靈方灌胃干預(yù)治療后，采用皮下注射吲哚美辛進(jìn)一步誘導(dǎo)藥源性胃黏膜損傷的疾病模型，觀察大鼠胃黏膜組織的病理變化及胃黏膜細(xì)胞的凋亡情況，來(lái)探討參靈方對(duì)AA大鼠胃黏膜損傷的干預(yù)保護(hù)機(jī)制，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠60只，雌雄各半，清潔級(jí)，體質(zhì)量150～180g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):810146。

1.1.2 藥品及試劑 參靈方，主要藥物組成黨參、黃柏、五味子，中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院中藥房提供，取各等份中藥39 g，加水超出藥面2～3 cm，浸泡1 h，文火煎煮2次，每次40 min，濃縮成1 g/mL，冰箱保存?zhèn)溆?吲哚美辛(消炎痛)原藥粉，江蘇太倉(cāng)制藥廠，批號(hào):070713;鹽酸雷尼替丁膠囊，山西太原藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14022109，批號(hào):070704;注射用卡介苗(50 mg/支)，上海生物制品研究所，批號(hào):20090312;原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 YSQ-SG46-280S不銹鋼手提式高壓蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;CS501型超級(jí)恒溫水浴，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;Olympus顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社;CMIS-2011細(xì)胞醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司;Citadel2000脫水機(jī)，英國(guó)珊頓公司;YT-6B型烤片機(jī)，湖北孝亞光電子技術(shù)研究所;TMY-781B微波儀，浙江臨安電子儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立及分組 將60只大鼠隨機(jī)抽取10只作為空白對(duì)照組，其余50只采用配制好完全弗氏佐劑，按每只大鼠0.1 mL于右后足跖皮內(nèi)注射制作AA模型。次日即可出現(xiàn)足部腫脹，第4 d腫脹達(dá)到高峰，然后逐漸減輕，第10 d再次腫脹，造模19 d后，將出現(xiàn)二次反應(yīng)的大鼠隨機(jī)取30只，分為模型對(duì)照組、雷尼替丁對(duì)照組及參靈方組，每組10只。

1.2.2 灌胃給藥 造模19 d后，雷尼替丁對(duì)照組予鹽酸雷尼替丁膠囊30mg/(kg·d)灌胃;參靈方組予參靈方7 g/(kg·d)灌胃;空白對(duì)照組及模型對(duì)照組分別予等容積的0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組大鼠均灌胃28 d，于最后1次灌胃結(jié)束后各組大鼠禁食不禁水24 h，模型對(duì)照組、雷尼替丁對(duì)照組及參靈方組均腹部皮下注射吲哚美辛30 mg/Kg(溶于5%NaHCO3溶液中)進(jìn)一步誘導(dǎo)藥源性胃黏膜損傷模型，7 h后采集標(biāo)本。

1.2.3 觀察項(xiàng)目及方法

1.2.3.1 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 觀察記錄各組大鼠灌胃前及灌胃28 d后全身關(guān)節(jié)病變程度，按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)［2］。0分:無(wú)紅腫;1分:有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹;2分:關(guān)節(jié)部位中度腫脹;3分:嚴(yán)重腫脹;4分:關(guān)節(jié)變形，不能負(fù)重)。關(guān)節(jié)炎指數(shù)=四肢關(guān)節(jié)評(píng)分之和。

1.2.3.2 標(biāo)本的采集及處理 將各組大鼠麻醉后打開(kāi)胸腔，剖腹，在食管與賁門部做雙重結(jié)扎，中間剪斷，首先用鑷子提起胃賁門部，切斷靠近賁門的食管，一邊牽拉，一邊切斷周圍韌帶，使胃同周圍組織分離，結(jié)扎幽門后剪斷，然后將胃取出，取胃后沿胃大彎側(cè)剪開(kāi)胃腔，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗凈胃腔，在胃腺區(qū)的相同部位切取0.5 cm×1.0 cm組織塊，以大頭針?lè)牌焦潭ㄔ谑炂髅笊?，放?%多聚甲醛溶液中固定。光學(xué)顯微鏡觀察胃黏膜組織病理變化，TUNEL法檢測(cè)胃黏膜細(xì)胞凋亡情況.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差分析前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠灌胃前及灌胃28 d后關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠灌胃前及灌胃28 d后關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化比較分，±s

表1 各組大鼠灌胃前及灌胃28 d后關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化比較分，±s

與空白對(duì)照組比較，* P＜0.05

組 別 n 灌胃前 灌胃28 d后10 0 0模型對(duì)照組 10 15.31 ±1.43* 15.69 ±1.94*雷尼替丁對(duì)照組 10 14.38 ±1.91* 14.21 ±1.75*參靈方組 10 14.63 ±1.29* 13.09 ±1.13空白對(duì)照組*

由表1可見(jiàn)，灌胃前及灌胃28 d后模型對(duì)照組、雷尼替丁對(duì)照組及參靈方組關(guān)節(jié)炎指數(shù)與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明AA大鼠模型復(fù)制成功。

2.2 各組大鼠胃黏膜病理學(xué)觀察 空白對(duì)照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)層次清楚，上皮結(jié)構(gòu)完整無(wú)損，腺體排列整齊(見(jiàn)封3，圖1);模型對(duì)照組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞明顯受損，脫落，上皮結(jié)構(gòu)不完整，部分黏膜中斷，局部腺體結(jié)構(gòu)紊亂，黏膜表面及腺腔內(nèi)較多脫落的上皮細(xì)胞碎片(壞死區(qū)可見(jiàn)少量含鐵血黃素)及滲出物(可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn))(見(jiàn)封3，圖2);參靈方組及雷尼替丁對(duì)照組大鼠胃黏膜局部上皮脫落較少，黏膜內(nèi)血管充血，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)封 3，圖 3、圖 4)。

2.3 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡情況比較 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡情況比較%，±s

表2 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡情況比較%，±s

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05

組 別 n 細(xì)胞凋亡指數(shù)空白對(duì)照組10 5.65 ±0.72模型對(duì)照組 10 56.61 ±7.82*雷尼替丁對(duì)照組 10 38.63 ±5.67△參靈方組 10 32.39 ±4.62△

空白對(duì)照組大鼠胃黏膜凋亡細(xì)胞主要位于表面上皮細(xì)胞內(nèi)，呈簇狀分布或單個(gè)散在分布，TUNEL陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)為棕黃色，位于細(xì)胞核內(nèi)(濃縮的核質(zhì)緊貼于核膜，或核質(zhì)呈現(xiàn)均勻的染色)(見(jiàn)封3，圖5)。由表2可見(jiàn)，模型對(duì)照組胃黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，明顯增加(見(jiàn)封3，圖6);雷尼替丁對(duì)照組及參靈方組胃黏膜細(xì)胞細(xì)胞凋亡指數(shù)與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，均明顯下降(見(jiàn)封3，圖7、圖8)，而雷尼替丁對(duì)照組與參靈方組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明2組均減少了AA大鼠的胃黏膜細(xì)胞凋亡，且療效相當(dāng)。

3 討論

RA病因至今并不十分明了，在其發(fā)病過(guò)程中本身可造成消化系統(tǒng)損害。劉健等［3］研究表明，AA大鼠胃黏膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變率升高，表現(xiàn)為線粒體腫脹變性，棘突破壞和消失，胃黏膜細(xì)胞凋亡率高于正常組，這可能是RA患者胃黏膜損傷的原因之一。另外，抗風(fēng)濕藥物也常引起的消化系統(tǒng)損害。國(guó)外研究人員調(diào)查發(fā)現(xiàn)，RA患者服用阿司匹林胃潰瘍發(fā)病率為80.6%，而正常人服用阿司匹林發(fā)病率僅為44.8%，且25%的藥物副作用報(bào)告是由非甾體抗炎藥(NSAIDs)引起［4-5］。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡方式，胃黏膜正常結(jié)構(gòu)的維持有賴于上皮細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖之間的動(dòng)態(tài)消長(zhǎng)平衡，細(xì)胞凋亡在胃黏膜損傷修復(fù)過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用［6］，已證實(shí)正常胃黏膜細(xì)胞存在凋亡，這是一種以基因表達(dá)、DNA合成為特征的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，在正常情況下，2種蛋白在胃黏膜都有表達(dá)并保持動(dòng)態(tài)平衡，如細(xì)胞凋亡過(guò)度必將破壞胃黏膜的完整性，進(jìn)而造成胃黏膜的損傷，因此細(xì)胞凋亡與增殖之間的失衡是胃黏膜損傷發(fā)生的重要因素，胃黏膜損傷與各種刺激導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)［7-8］。

參靈方為純中藥方劑，具有健脾益氣、和胃燥濕之功。方中黨參益氣健脾;黃柏清熱燥濕，解毒療瘡;五味子收斂固澀，益氣生津。有研究證實(shí)，黨參對(duì)胃黏膜具有較好的保護(hù)作用［9］，黨參注射液能夠上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的表達(dá)，提示黨參能抵抗氧自由基損傷，屬?gòu)?qiáng)抗氧化藥物［10］。復(fù)方黃柏液具有明顯的抗感染及促進(jìn)傷口愈合的作用［11］。五味子具有抗損傷、抗氧化、抗?jié)儭⒖箲?yīng)激及抑菌作用，去氧五味子素可抑制胃酸分泌，有顯著的抗?jié)冏饔茫?2］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)層次清楚，上皮結(jié)構(gòu)完整無(wú)損。模型組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞明顯受損，脫落，上皮結(jié)構(gòu)不完整，胃黏膜細(xì)胞凋亡明顯增加。參靈方組大鼠經(jīng)參靈方干預(yù)治療后，胃黏膜局部上皮脫落較少，凋亡指數(shù)也明顯下降，說(shuō)明參靈方減少了AA大鼠吲哚美辛引起的胃黏膜細(xì)胞凋亡，其可能是通過(guò)增加細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡而抑制胃黏膜細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用。

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