雙參活血膠囊中藥成分鑒定與丹參酮ⅡA的測(cè)定

于天蔚

(河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，河北 唐山 063000)

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及新的檢驗(yàn)設(shè)備應(yīng)用，尤其是高效液相色譜(HPLC)儀在藥品檢驗(yàn)方面的推廣，提高了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平［1］。HPLC具有快速、靈敏的特點(diǎn)，能同時(shí)進(jìn)行定性及定量的測(cè)定。中成藥的檢測(cè)較之西藥更具有一定的難度與復(fù)雜性，特別是復(fù)方制劑［2］。雙參活血膠囊為研發(fā)自制藥，主要成分為人參、丹參及益母草。為了確保藥品質(zhì)量，本研究通過對(duì)其中人參、丹參及益母草采用薄層色譜(TLC)法對(duì)其進(jìn)行鑒別，并采用HPLC法測(cè)定雙參活血膠囊中丹參酮ⅡA的含量，結(jié)果如下。

1 材料

1.1 儀器 美國Waters公司2690 HPLC儀、雙通道2487紫外檢測(cè)器及Millennium32色譜數(shù)據(jù)工作站;日本島津公司UV2401型紫外-可見分光光度計(jì)、CTO-10ASVP柱溫箱及SPD-10Avp型紫外檢測(cè)器;美國G1311A Agilent四元泵及G13222-脫氣機(jī);北京瑞邦興業(yè)科技有限公司KQ-250DE臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器;上海天平儀器廠TG-332A微量天平。

1.2 藥品及試劑 雙參活血膠囊，中國藥品生物檢定所提供，批號(hào):766200213;人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、丹參酮ⅡA、鹽酸小蘇堿及色譜純，上海豪申化學(xué)試劑有限公司;滅菌蒸餾水，安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司;甲純?yōu)樯V純，其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil G18(4.6 mm ×200.0 mm，10 μm);流動(dòng)相:甲醇 - 水(80∶20);柱溫:30℃;流量:1.0 mL/min;檢測(cè)波長:268 nm;進(jìn)樣量:20 μL［3-4］。

2.1.2 溶液制備 雙參活血膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取1 g置于50 mL容量瓶中，加入25 mL甲醇，超聲處理15 min，搖勻，過濾，制成供試品溶液。另按處方比例稱取處方量的人參及益母草等除丹參以外的藥材，同工藝、同方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 首先取4 mg丹參酮ⅡA，置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解并定容為0.40 mg/mL的對(duì)照品溶液，分別取 0.6、0.5、0.4、0.3、0.2 mL 的0.40 mg/mL對(duì)照品溶液置于10 mL容量瓶中，分別加入甲醇定容，搖勻后以0.45 μm微孔濾膜過濾，分別取20 μL進(jìn)樣。按樣品處理標(biāo)準(zhǔn)操作，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，以待測(cè)物濃度C為縱坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積A為橫坐標(biāo)，回歸方程:Y=1.424 ×105+4.107 ×104(r2=0.999 40)。計(jì)算出濃度為0.08 ～0.24 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.4 干擾試驗(yàn) 分別精密吸取20 μL丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液，進(jìn)樣，測(cè)定。結(jié)果在供試品溶液色譜及對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置均有一保留時(shí)間相同的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在此保留時(shí)間內(nèi)無干擾。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取 20 μL 0.24 μg/mL 的丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定5次。測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)=0.65%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 首先取在室溫下保存的丹參酮ⅡA 0.40 mg/mL 對(duì)照品溶液分別在第1、2、4、6、8 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.7%，顯示該方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品，精密稱取5份，按1.3.2項(xiàng)方法制成供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，平均每份含丹參酮ⅡA 0.220 g，RSD=0.56%。

2.1.8 樣品含量測(cè)定 精密稱取5份雙參活血膠囊各1 g按 1.3.2 項(xiàng)方法制成供試品溶液，吸取 20 μL 24 μg/mL丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液及供試品溶液，進(jìn)樣，分別對(duì)丹參酮ⅡA的峰面積進(jìn)行測(cè)定，并用外標(biāo)法對(duì)測(cè)定結(jié)果的含量進(jìn)行計(jì)算，含量分別為 0.218、0.217、0.216、0.212、0.210 mg。

2.1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取5份已測(cè)含量的丹參酮ⅡA，分別加入丹參酮ⅡA 0.40 mg/mL對(duì)照品溶液，對(duì)回收率進(jìn)行測(cè)定。樣品測(cè)定丹參酮ⅡA平均回收率為97.6%，DRS=1.05%，符合規(guī)定。見表1。

表1 5份已測(cè)含量的丹參酮ⅡA加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.2 中藥成份鑒定

2.2.1 人參的鑒定

2.2.1.1 溶液制備 取雙參活血膠囊10粒研勻，加乙醚30 mL，超聲處理10 min后常規(guī)過濾，加入50 mL水飽和的正丁醇，超聲處理30 min后過濾，加入0.5%氫氧化鈉溶液洗滌后，將0.5%氫氧化鈉溶液棄去，加入水飽和的正丁醇水洗至中性。取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)尤爰状? mL溶解，作為供試品溶液。同時(shí)按照上述供試品溶液制備方法，精密稱取人參1 g，制成對(duì)照藥材溶液;另取人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1加入甲醇配制為1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。根據(jù)雙參活血膠囊處方比例，稱取丹參、益母草等除人參以外的藥材，同工藝制成陰性成品，按照上述方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.1.2 鑒定方法 分別吸取上述不同溶液各4～6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以13∶7∶2的三氯甲烷-甲醇-水于10℃以下放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，雙參活血膠囊各供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顏色斑點(diǎn)相同，在此位置上陰性對(duì)照無斑點(diǎn)顯示(見圖1)。

2.2.2 丹參的鑒定

2.2.2.1 溶液制備 取雙參活血膠囊10粒研勻，加乙醚40 mL，超聲處理30 min后常規(guī)過濾，殘?jiān)右宜嵋阴? mL溶解，作為供試品溶液。精密稱取丹參1 g，加入75%乙醇30 mL，加熱回流1 h，過濾并蒸干濾液，殘?jiān)訜崴?0 mL溶解，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，后用乙醚振搖提取并合并乙醚液，蒸干，加入乙酸乙酯使殘?jiān)芙?，作為?duì)照藥材溶液。取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加乙酸乙酯制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。根據(jù)雙參活血膠囊處方比例，稱取人參、益母草等除丹參以外的藥材，同工藝制成陰性成品，按照上述方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.2.2 鑒定方法 分別吸取上述不同溶液各10～15 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，雙參活血膠囊各供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顏色斑點(diǎn)相同，在此位置上陰性對(duì)照無斑點(diǎn)顯示(見圖1)。

2.2.3 益母草的鑒定

2.2.3.1 溶液制備 取雙參活血膠囊30粒研勻，加80%乙醇50 mL，加熱回流l h，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)觢%鹽酸5 mL溶解，過濾，由碳酸鈉調(diào)節(jié)濾液滴pH至8，過濾，蒸干，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為供試品溶液。精密稱取鹽酸水蘇堿對(duì)照品1 mg，制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。根據(jù)雙參活血膠囊處方比例，稱取人參、丹參等除益母草以外的藥材，同工藝制成陰性成品，按照上述方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.3.2 鑒定方法 分別吸取上述不同溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以比例為4∶1∶1的正丁醇-醋酸-水的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，晾干。供試品色譜中，雙參活血膠囊各供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顏色斑點(diǎn)相同，在此位置上陰性對(duì)照無斑點(diǎn)顯示(見圖1)。

3 討論

雙參活血膠囊是治療心腦血管疾病、各種血栓癥的復(fù)方純中藥制劑，具有通暢脈絡(luò)、活血化瘀的作用。為了對(duì)雙參活血膠囊的質(zhì)量進(jìn)行控制，本研究對(duì)制劑中的丹參、人參、益母草采用TCL定性鑒別，從鑒別結(jié)果顯示，供試品色譜中，雙參活血膠囊中人參、益母草及丹參各供試品在與對(duì)照品色譜及對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顏色斑點(diǎn)相同，在此位置上陰性對(duì)照無斑點(diǎn)顯示［5-7］。采用HPLC法對(duì)雙參活血膠囊中的主要成分丹參酮ⅡA進(jìn)行檢測(cè)，顯示5 份樣品含量分別為 0.218、0.217、0.216、0.212、0.210 mg。本研究結(jié)果說明，TLC法可對(duì)雙參活血膠囊中各中藥材進(jìn)行鑒定，丹參酮ⅡA是中藥丹參的脂溶性有效成分，以此指標(biāo)作為雙參活血膠囊的質(zhì)控指標(biāo)可準(zhǔn)確掌握每批藥品的質(zhì)量。

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