結(jié)核分枝桿菌重組fbpB編碼蛋白的原核表達(dá)

石 潔，朱巖昆，馬曉光，王少華，李 輝，邢 進(jìn)#，閆國(guó)蕊，靳曉偉

1)河南省疾病預(yù)防控制中心 鄭州 450016 2)新密市疾病預(yù)防控制中心 鄭州 452370

結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌感染所引起的一種高發(fā)病率和病死率的傳染病。目前，全球大約三分之一的人口被結(jié)核桿菌所感染，其中有5%～10%的潛伏感染者會(huì)發(fā)展至活動(dòng)性肺結(jié)核。據(jù)估計(jì)，每年有900萬的活動(dòng)性肺結(jié)核的新發(fā)病例，并且每年有200萬人死亡[1-2]。中國(guó)是TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)僅次于印度而居世界第2位。BCG作為一種活性減弱的牛分枝桿菌，是目前惟一有效的結(jié)核病抗原，對(duì)感染分枝桿菌的動(dòng)物模型有很強(qiáng)保護(hù)作用。盡管BCG抗原對(duì)患有結(jié)核性腦膜炎和粟粒性肺結(jié)核等重癥結(jié)核的兒童有很好的保護(hù)作用，然而不同研究[3]顯示，BCG在不同人群中的保護(hù)性不穩(wěn)定，對(duì)成人肺結(jié)核的保護(hù)效率介于0%～80%。結(jié)核桿菌分泌蛋白中，Ag85復(fù)合物家族成員(Ag85A、B、C)被認(rèn)為是最具潛力的疫苗候選物[4]，并且Ag85A和Ag85B的應(yīng)用最廣。該研究以Ag85B為研究對(duì)象，將其編碼基因fgbB連接至含有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體，并將體外高效表達(dá)純化的重組蛋白用于患者的免疫學(xué)檢測(cè)，為進(jìn)一步研究TB的早期診斷和免疫疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株，E.coil BL21(DE3)，E.coil DH10B，原核表達(dá)載體pET28a均由河南省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室保存。分子生物學(xué)和常規(guī)生化試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。His純化珠子購自GE公司，膠回收試劑盒、50 bp DNA Ladder Marker、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。

1.2 結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)編碼結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B的基因fbpB序列設(shè)計(jì)引物如下:上游5'-GGGCG GATCCATGACAGACGTGAGCCGAAAG-3'，下 游 5'-GATCGAATTCGCCGGCGCCTAACGAACT-3'，分別引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。提取H37Rv基因組DNA，并作為模板，PCR擴(kuò)增fbpB基因，切膠回收目的片段，經(jīng) BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切后，與pET28a載體連接反應(yīng)過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coil DH10B的感受態(tài)細(xì)胞中，菌落PCR篩選陽性克隆pET28a-fbpB，并送至上海英俊測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3 Ag85B蛋白的原核表達(dá)和純化 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a-fgbB轉(zhuǎn)化至E.coil BL21菌株中，挑取單克隆菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩過夜，1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)至 A600nm大約為0.6，加入IPTG誘導(dǎo)，觀察不同的溫度和不同時(shí)間下的誘導(dǎo)結(jié)果。離心收集菌體沉淀，加入含有蛋白酶抑制劑的PBS裂解緩沖液，冰浴超聲后，分別取上清和沉淀，用120 g/L的SDS-PAGE蛋白膠進(jìn)行垂直電泳檢測(cè)。IPTG純化誘導(dǎo)培養(yǎng)重組菌50 mL，離心后加入含有蛋白酶抑制劑PMSF的PBS超聲破碎液，離心取上清。加入His純化柱4℃反應(yīng)過夜，用His banding buffer洗滌2次后，加入 His washing buffer進(jìn)行洗脫。取上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定。

1.4 純化蛋白的Western blot鑒定 制備100 g/L的SDS-PAGE凝膠，恒壓80 V電泳20 min，轉(zhuǎn)換至恒壓130 V繼續(xù)電泳60 min，按照Bio-Rad公司的半干轉(zhuǎn)移的方法，恒流60 mA電泳轉(zhuǎn)膜30 min，將SDS-PAGE凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜用50 g/L脫脂奶粉孵育1 h，以降低蛋白質(zhì)與抗體之間的非特異性結(jié)合。用鼠源His一抗(稀釋2000倍)于4℃孵育過夜，TBST洗滌3次后，再用稀釋1000倍的兔抗鼠二抗在室溫條件下孵育2 h，用TBST洗滌后加入底物進(jìn)行顯色或者曝光。當(dāng)?shù)鞍讕У念伾疃冗_(dá)到要求時(shí)終止反應(yīng)。

1.5 ELISA檢測(cè)純化蛋白對(duì)患者的免疫原性 將純化的融合蛋白His-Ag85B蛋白分別與27例臨床可疑結(jié)核病患者血清(由新密市結(jié)核病防治所提供)進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。將純化的His-Ag85B用碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6)稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 mg/L。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 mL，4℃過夜。棄去孔內(nèi)抗原，用PBST洗滌3次后，體積分?jǐn)?shù)3%的牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉1 h，洗滌后加入患者稀釋100倍的血清37℃孵育反應(yīng)2 h。再次洗滌3次后加入稀釋10000倍HRP偶聯(lián)的兔抗人的二抗37℃孵育反應(yīng)1 h，洗滌后加入底物于37℃反應(yīng)30 min顯色。用2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，在ELISA檢測(cè)儀上于450 nm處以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔吸光度(A)值，大于規(guī)定的陰性對(duì)照A值的2.1倍為陽性。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-fbpB的鑒定 所有挑取的克隆均能擴(kuò)增出目的基因大小一致的1000 bp左右條帶，初步鑒定為陽性克隆，見圖1。為排除PCR擴(kuò)增造成假陽性，選取經(jīng)初步鑒定的一個(gè)陽性克隆用BamHⅠ/EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切。該質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后可釋放1000 bp左右的目的條帶，進(jìn)一步表明了重組質(zhì)粒的正確性(圖2)。對(duì)該克隆進(jìn)行DNA測(cè)序比對(duì)，其序列與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a-fbpB菌落的PCR鑒定

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-fbpB的酶切鑒定

2.2 Ag85B重組蛋白的純化和鑒定 經(jīng)His純化后的總蛋白考馬斯亮藍(lán)染色后，在35000左右有明顯的亮帶(圖3)，為帶His標(biāo)簽的目的蛋白Ag85B。Western blot結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量35000處有明顯反應(yīng)條帶的，為His融合的Ag85B目的蛋白(圖4)。

圖3 融合蛋白純化后的SDS-PAGE鑒定

圖4 融合蛋白的Western blot檢測(cè)

2.3 Ag85B重組蛋白對(duì)結(jié)核病患者的ELISA檢測(cè)結(jié)果 15個(gè)胸片診斷陽性疑似肺結(jié)核患者血清在450 nm的A值均在0.78以上，平均為0.83。所有非結(jié)核患者樣本的A值均小于0.08，平均為0.05。純化的Ag85B-His融合蛋白能較好地檢測(cè)結(jié)核病患者血清標(biāo)本。

3 討論

肺結(jié)核是嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染病[5-8]。近年來，隨著流動(dòng)人口的增加，耐多藥菌株數(shù)量增多以及結(jié)核病和艾滋病的雙重感染，使得結(jié)核病的防控形勢(shì)更加嚴(yán)峻。目前結(jié)核病的化療方案遠(yuǎn)非理想，需要長(zhǎng)期攝入多種抗結(jié)核藥物。由于目前化療方案的副作用大，治療周期長(zhǎng)，容易導(dǎo)致貧窮患者的依從性差，治療失敗，引起耐藥菌株的出現(xiàn)[7]。因此，亟待開發(fā)結(jié)核病更加快速有效的治療方案。由于大多數(shù)感染者并不發(fā)病，只有大約10%的潛伏感染者會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核[9]，因此，在這種情況下，使用免疫療法，可能成為結(jié)核病抗菌化學(xué)療法的重要輔助手段。DNA疫苗可建立細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此成為預(yù)防和治療結(jié)核病的新熱點(diǎn)。

結(jié)核桿菌抗原Ag85復(fù)合物是快速生長(zhǎng)結(jié)核分枝桿菌的主要分泌蛋白，含量占到所有分泌蛋白的30%[10]，其含有 3種編碼不同但抗原相關(guān)的蛋白[11]。Ag85通過介導(dǎo)結(jié)核桿菌與T細(xì)胞的纖維黏連蛋白相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)了結(jié)核菌素的延遲超敏反應(yīng)[12]。近年來，研究[13]表明 Ag85B 作為一種 DNA疫苗，可有效地抑制小鼠肺組織中結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)。

為進(jìn)一步研究Ag85B的免疫學(xué)功能，該研究通過基因重組技術(shù)將早期分泌抗原Ag85B的編碼基因fbpB克隆到含有His的pET28a載體上，并通過原核表達(dá)和純化得到了重組蛋白His-Ag85B。采用ELISA法檢測(cè)該重組蛋白對(duì)結(jié)核病患者血清的免疫原性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)結(jié)核病患者的血清樣本能特異性地識(shí)別，以上結(jié)果為進(jìn)一步研究Ag85B的免疫學(xué)功能提供了初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]Sala C，Hartkoorn RC.Tuberculosis drugs:new candidates and how to find more[J].Future Microbiol，2011，6(6):617

[2]Hanta I，Ozbek S，Kuleci S，et al.Detection of latent tuberculosis infection in rheumatologic diseases before anti-TNF-α therapy:tuberculin skin test versus IFN-γ assay[J].Rheumatol Int，2012，32(11):3599

[3]You Q，Jiang C，Kong W，et al.Attempted immunotherapy for Mycobacterium tuberculosis with viral and protein vaccines based on Ag85B-ESAT6 in a mouse model[J].Acta Microbiol Immunol Hung，2012，59(1):63

[4]Kaufmann SH，Hussey G，Lambert PH.New vaccines for tuberculosis[J].Lancet，2010，375(9731):2110

[5]Flynn JL，ChanJ.Immunology of tuberculosis[J].Annu Rev Immunol，2001，19:93

[6]Rook GA，Seah G，Ustianowskia AM.Tuberculosis:immunology and vaccination[J].Eur Respir J，2001，17(3):537

[7]Young D，Dye C.The development and impact of tuberculosis vaccines[J].Cell，2006，124(4):683

[8]Young DB，Duncan K.Prospects for new interventions in the treatment and prevention of mycobacterial disease[J].Annu Rev Microbiol，1995，49:641

[9]Bishai WR，Graham NW，Harrington S，et al.Molecular and geographic patterns of tuberculosis transmission after 15 years of directly observed therapy[J].JAMA，1998，280(19):1679

[10]Kennedy MW，Tierney J，Ye P，et al.The secreted and somatic antigens of the third stage larva of Anisakis simplex，and antigenic relationship with Ascaris suum，Ascaris lumbricoides，and Toxocara canis[J].Mol Biochem Parasitol，1988，31(1):35

[11]Harboe M，Wiker HG，Nagai S.Protein antigens of mycobacteria studied by quantitative immunologic techniques[J].Clin Infect Dis，1992，14(1):313

[12]Godfrey HP，F(xiàn)eng Z，Mandy S，et al.Modulation of expression of delayed hypersensitivity by mycobacterial antigen 85 fibronectin-binding proteins[J].Infect Immun，1992，60(6):2522

[13]Zhu D，Jiang S，Luo X.Therapeutic effects of Ag85B and MPT64 DNA vaccines in a murine model of Mycobacterium tuberculosis infection[J].Vaccine，2005，23(37):4619