雌、孕激素下降對(duì)大鼠腎臟組織中水通道蛋白表達(dá)的影響

衛(wèi) 紅，王貴憲，徐紀(jì)中，袁維堂，衛(wèi) 軍

1)河南司法警官職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心 鄭州 450000 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸外科 鄭州 450052 3)武警河南總隊(duì)醫(yī)院感染管理科 鄭州 450052

卵巢甾類(lèi)激素通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟對(duì)水分的重吸收等一系列復(fù)雜機(jī)制參與機(jī)體水代謝的調(diào)節(jié)[1]。血液循環(huán)中雌激素或孕酮水平的增高[2]或降低[3]都會(huì)導(dǎo)致明顯的水鈉潴留、血容量增加[4]。研究[5]表明，分布于腎臟的水通道蛋白(aquaporin，AQP)與水的重吸收關(guān)系密切。雌激素和孕酮可通過(guò)影響血漿垂體后葉激素如血管加壓素(AVP)和催產(chǎn)素的分泌從而調(diào)節(jié)腎臟 AQP表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控水代謝平衡[6]。該研究觀察了卵巢切除(ovariectomy，OVX)后大鼠腎臟組織AQP表達(dá)的改變以及伴隨的腎臟水代謝異常，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇3個(gè)月的雌性慕尼黑大鼠60只，初始體重200 g左右，喂養(yǎng)環(huán)境為12 h:12 h人工白天、黑夜循環(huán)，室內(nèi)溫度維持在(21±2)℃，濕度維持在55% ±2%。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為2組，即OVX組(n=30)和對(duì)照組(Sham組，n=30)。OVX組:采用氟烷吸入麻醉，將大鼠放置在自動(dòng)調(diào)節(jié)的加溫平臺(tái)上，使其在手術(shù)期間直腸內(nèi)溫度維持在35.5～37.0℃。采用腹部正中切口，顯露卵巢和輸卵管，結(jié)扎輸卵管后，切除雙側(cè)卵巢。Sham組:在氟烷吸入麻醉下行剖腹探查，顯露卵巢和輸卵管，但不結(jié)扎切除。

1.2 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單獨(dú)放置在代謝籠內(nèi)，每日留取尿樣待檢。術(shù)后0、2、4周2組分別取10只大鼠，在氟烷吸入麻醉下，先通過(guò)主動(dòng)脈抽血，留取血樣待檢;然后快速切除雙側(cè)腎臟，左側(cè)腎臟置入40 g/L的多聚甲醛中用于免疫組化檢測(cè);右側(cè)腎臟放置在冰面上，分離出內(nèi)髓和皮質(zhì)，切碎后分別加入含蛋白酶抑制劑的解剖緩沖液后勻漿，勻漿液在4℃、4000 g條件下離心15 min，保留上清液待檢。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 分別于術(shù)后0、2、4周進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.1 體重、飲水量、尿量、尿和血漿滲透壓 2組均在處死動(dòng)物留取標(biāo)本前1 d使用代謝籠記錄動(dòng)物尿量和飲水量，使用電子稱(chēng)重儀測(cè)定動(dòng)物體重，使用滲透壓測(cè)定儀測(cè)定尿和血漿滲透壓。

1.3.2 血漿雌、孕激素和AVP水平 使用自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)量血漿中雌、孕激素和AVP水平。

1.3.3 腎臟組織AQP 用Shimadz分光光度計(jì)對(duì)各個(gè)標(biāo)本的總蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出在相同的蛋白量時(shí)所需要點(diǎn)樣的樣本量，細(xì)微的誤差通過(guò)在120 g/L的聚丙烯酰胺膠板上進(jìn)行考馬斯亮蘭校正，再進(jìn)行免疫印跡法測(cè)定?？贵w為AQP2(稀釋度為1∶1000)、p-AQP2(稀釋度為 1∶1000)、AQP1(稀釋度為1∶500)和AQP3(稀釋度為1∶100)，所有抗體均來(lái)源于丹麥奧胡斯大學(xué)水鹽研究中心，阻斷抗體是P448(為羊抗兔抗體，稀釋度1∶3000)。免疫組化SP法檢測(cè)及定量采用文獻(xiàn)[7]的方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠體重、飲水量、尿量、尿和血漿滲透壓結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠體重、飲水量、尿量、尿和血漿滲透壓的比較

2.2 2組大鼠血漿雌、孕激素和AVP水平 結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 2組大鼠腎臟組織AQP的表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)圖1、2和表2。

表2 2組大鼠血漿雌、孕激素和AVP水平及腎臟組織AQP表達(dá)水平的比較

圖1 2組術(shù)后2周腎臟組織中AQP2、p-AQP2、AQP1及AQP3的表達(dá)情況(SP，×400)

圖2 2組術(shù)后2周腎臟組織中AQP2(A)、p-AQP2(B)、AQP1(C)及AQP3(D)表達(dá)的免疫印跡結(jié)果

3 討論

該研究發(fā)現(xiàn)大鼠OVX后血漿雌激素和孕激素水平下降，血漿AVP水平升高，腎臟AQP2、AQP1、AQP3的表達(dá)增強(qiáng)，且伴隨著明顯的尿量減少和體重增加，提示OVX后的尿量減少和水潴留與腎臟AQP2、AQP1、AQP3的表達(dá)上升有關(guān)。由此推測(cè)絕經(jīng)期婦女女性激素水平的下降和血漿AVP水平的升高在腎臟對(duì)水的異常處理中發(fā)揮了重要作用。

3.1 OVX后尿量減少的同時(shí)AQP2的表達(dá)增加AQP2分布在腎小管主細(xì)胞表膜以及胞質(zhì)內(nèi)[8]，AVP使主細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的AQP2轉(zhuǎn)移至胞膜上，從而增加對(duì)水分的重吸收，為快速調(diào)節(jié)機(jī)制[9]。而慢調(diào)節(jié)機(jī)制是通過(guò) AQP2 mRNA轉(zhuǎn)錄，增加蛋白表達(dá)總量[10]。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了OVX后2和4周AQP2的表達(dá)明顯增加，與之相對(duì)應(yīng)的是血漿AVP水平升高，推測(cè)OVX后AVP的升高導(dǎo)致了AQP2的表達(dá)增強(qiáng)，使腎小管對(duì)水分的吸收增加，致使尿量減少。但是OVX后2和4周的具體調(diào)節(jié)機(jī)制(快速調(diào)節(jié)機(jī)制/慢調(diào)節(jié)機(jī)制)并不清楚，需要進(jìn)一步研究。p-AQP2是 PKA引發(fā)的磷酸化 AQP2，當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)的AQP2轉(zhuǎn)移至胞膜時(shí)，是p-AQP2的形式[5]。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OVX后2和4周，p-AQP2的表達(dá)均升高，推測(cè)血漿AVP的升高致使AQP2磷酸化增加，從而增加了水分重吸收，致使尿量減少。另外，該研究發(fā)現(xiàn)p-AQP2和AQP2表達(dá)量均明顯上升，說(shuō)明2種調(diào)節(jié)機(jī)制均參與了OVX后腎小管對(duì)水的重吸收。

3.2 OVX后腎臟組織AQP3和AQP1的表達(dá)增加 AQP1位于腎臟近端小管和亨利袢的降枝細(xì)段細(xì)胞的頂膜和基底膜上，主要作用是使水分穿透細(xì)胞膜的頂膜和基底膜，重吸收水分[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)缺乏AQP1時(shí)，在應(yīng)用AVP或缺水狀態(tài)時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出尿液濃縮障礙。該研究中OVX后AQP1表達(dá)的持續(xù)增高，可能與雌激素水平下降后機(jī)體的水潴留有關(guān)，其調(diào)節(jié)機(jī)制需進(jìn)一步探討。

AQP2吸收到主細(xì)胞內(nèi)的水分通過(guò)分布在主細(xì)胞側(cè)基底膜上的 AQP3和 AQP4進(jìn)入體循環(huán)[5]。AVP調(diào)節(jié)下集合管對(duì)尿液的濃縮也主要是通過(guò)AQP2、AQP3 和 AQP4 完成[10]。剔除了 AQP3 和AQP4的小鼠出現(xiàn)明顯的多尿以及尿液濃縮功能受損[13]。該研究結(jié)果顯示OVX后伴隨著AQP2表達(dá)的升高，AQP3的表達(dá)也同樣升高。有研究[13]表明除了AQP2調(diào)節(jié)以外，AQP3也參與了AVP和體內(nèi)水平衡變化的調(diào)節(jié)。研究[14]顯示AQP3主要存在于細(xì)胞的側(cè)基底膜上，幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)顆粒，這提示AQP3沒(méi)有像AQP2那樣的快速調(diào)節(jié)機(jī)制。

綜上所述，OVX后雌、孕激素水平下降而血漿AVP水平上升，致使腎臟組織 AQP2、AQP1、AQP3表達(dá)升高，與之相應(yīng)的是尿量減少和體重增加。推測(cè)OVX后雌、孕激素的減少產(chǎn)生的體內(nèi)液體潴留可能與腎臟對(duì)水分的重吸收增加有關(guān)，其作用至少部分是通過(guò)AVP對(duì)AQP的調(diào)節(jié)途徑進(jìn)行。

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