17β-雌二醇對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響*

王 悅，計(jì)阿丹，肖永紅

河北聯(lián)合大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室 唐山 063000

矽肺是我國(guó)目前常見且危害性嚴(yán)重的一種職業(yè)病，臨床表現(xiàn)主要為肺部彌漫性纖維化。肺纖維化最顯著的特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)大量合成，降解受到抑制，造成富含膠原的ECM大量沉積，形成纖維化。現(xiàn)有研究[1]表明小凹蛋白(caveolin-1)是細(xì)胞膜上信號(hào)分子富集區(qū)-質(zhì)膜囊泡結(jié)構(gòu)的主要功能性結(jié)構(gòu)蛋白，它穿梭于胞質(zhì)與胞膜之間，結(jié)合胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制膠原的沉積以及肺纖維化的發(fā)展。17β-雌二醇(17β-estradiol，17β-E2)可以誘導(dǎo)小凹蛋白的表達(dá)，提示17β-E2可能參與了肺纖維化的過(guò)程[2]。作者觀察了17β-E2對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，以期為肺纖維化的治療提供新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肺成纖維細(xì)胞株L929細(xì)胞(上海博谷生物公司)于液氮中存儲(chǔ)。將17β-E2(北京博奧森生物公司)溶解于二甲基亞砜(DMSO)，制成濃度為10－2mol/L的母液，然后用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成濃度為 10－6、10－7、10－8mol/L 的藥液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩⒂坞xSiO2顆粒(95%以上的顆粒直徑＜5 μm，購(gòu)于中國(guó)預(yù)防科學(xué)院勞衛(wèi)所)充分研磨后于180℃干烤6 h，用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液配成SiO2質(zhì)量濃度為20、50、100 mg/L的溶液，4℃儲(chǔ)存。胎牛血清(杭州四季青公司)56℃水浴30 min滅活，4℃存儲(chǔ)備用。PBS緩沖液(北京四正柏生物公司)、DMSO(美國(guó)Sigma公司)常溫存放。四甲基偶氮唑鹽(MTT，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)粉劑經(jīng)無(wú)菌PBS配置成濃度為5 mg/L的溶液，－20℃存儲(chǔ)備用。碘化丙啶(PI)熒光染料(杭州聯(lián)科生物公司)，4℃儲(chǔ)存;RNA酶(杭州聯(lián)科生物公司)，－20℃存放。EPICS?ALTRATM型流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)，318MC型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(上海精科公司)。

1.2 L929細(xì)胞的培養(yǎng) 利用無(wú)菌超凈臺(tái)配制含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液?？焖偃〕鲆旱斜４娴男∈蠓纬衫w維細(xì)胞于37℃水浴箱復(fù)蘇，接種于完全培養(yǎng)液中，于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液，以防止殘留的DMSO影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

1.3 17β-E2對(duì)SiO2誘導(dǎo)的L929細(xì)胞增殖影響的觀察 采用 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)[3]，分析不同濃度SiO2、17β-E2及其干預(yù)時(shí)間3個(gè)因素對(duì)L929細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)定見表1。實(shí)驗(yàn)共分為9組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。倒置顯微鏡下見細(xì)胞貼壁、形態(tài)良好并呈單層致密狀時(shí)，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，制成密度為1×106mL－1的細(xì)胞懸液，按每孔200 μL接種在96孔板上，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋面積達(dá)培養(yǎng)瓶80%左右時(shí)加入無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液同步化24 h。每組先加入相應(yīng)劑量的SiO2誘導(dǎo)24 h，然后加入相應(yīng)濃度17β-E2作用相應(yīng)的時(shí)間，最后使用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出細(xì)胞增殖抑制效果較明顯(吸光度值較低)的實(shí)驗(yàn)條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 SiO2和17β-E2對(duì) L929細(xì)胞增殖影響的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.4 17β-E2對(duì)SiO2誘導(dǎo)的L929細(xì)胞周期分布影響的觀察 實(shí)驗(yàn)分成3組:空白對(duì)照組，SiO2誘導(dǎo)組，17β-E2干預(yù)組。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，胰酶消化，配制成細(xì)胞懸液，按1×106mL－1的密度接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁且呈單層致密狀，用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24 h，再分組處理?？瞻讓?duì)照組常規(guī)培養(yǎng);SiO2誘導(dǎo)組應(yīng)用實(shí)驗(yàn)用濃度的SiO2誘導(dǎo)細(xì)胞24 h;17β-E2干預(yù)組細(xì)胞經(jīng)SiO2誘導(dǎo)24 h后，用實(shí)驗(yàn)用劑量的17β-E2干預(yù)相應(yīng)時(shí)間。處理完成后，3組細(xì)胞經(jīng)2.5 g/L胰酶消化，收集并高速離心5 min，去除培養(yǎng)液，用PBS沖洗1次，加入體積分?jǐn)?shù)70%的冰乙醇4℃固定過(guò)夜。第2天離心去除固定液并重新用PBS懸浮細(xì)胞5 min，再次離心棄PBS后加入 400 μL PBS、40 μL PI和 2 μL RNA 酶室溫避光孵育10 min，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳實(shí)驗(yàn)條件;3組細(xì)胞周期分布的比較采用單因素方差分析和LSD-t法檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞增殖率測(cè)定、分析結(jié)果見表2、3。從表2、3可以看出，最佳實(shí)驗(yàn)條件篩選結(jié)果為:應(yīng)用20 mg/L SiO2誘導(dǎo)，用10－6mol/L的17β-E2干預(yù)24 h。

2.2 細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果 見表4。可以看出，SiO2誘導(dǎo)組小鼠肺成纖維細(xì)胞G1期細(xì)胞比例較空白對(duì)照組降低，S+G2期細(xì)胞比例升高;而17β-E2干預(yù)組G1期細(xì)胞比例較SiO2誘導(dǎo)組升高，S+G2期細(xì)胞比例降低(P ＜0.05)。*:與空白對(duì)照組比較，P＜0.05;#:與SiO2誘導(dǎo)組比較，P＜0.05。

表2 SiO2和17β-E2對(duì) L929細(xì)胞增殖影響的正交實(shí)驗(yàn)及極差分析結(jié)果

表3 單因素方差分析結(jié)果

表4 各組L929細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果 %

3 討論

肺成纖維細(xì)胞是肺纖維化過(guò)程中的重要細(xì)胞，它們具有合成膠原蛋白和纖維的能力[4]。肺成纖維細(xì)胞在受到游離SiO2誘導(dǎo)下過(guò)度增生，就會(huì)大量分泌膠原蛋白，進(jìn)而引起ECM大量合成和過(guò)度沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化[5]。現(xiàn)有研究[6]表明女性肝硬化的發(fā)病率明顯低于男性，提示雌激素在纖維化過(guò)程中可能起保護(hù)作用，而17β-E2作為女性體內(nèi)活性最強(qiáng)的雌激素，可能具有抗纖維化的作用。17β-E2可增加小鼠肺成纖維細(xì)胞內(nèi)小凹蛋白的表達(dá)，而小凹蛋白又能抑制信號(hào)分子的活化，如MEK、ERK、JNK、PI3K 和 Akt等，進(jìn)而抑制膠原合成[7]。有研究[8]表明17β-E2對(duì)細(xì)胞增殖具有雙重效應(yīng):低濃度17β-E2通過(guò)影響Cyclin D1的表達(dá)，促使細(xì)胞由G1期轉(zhuǎn)換到S期;高濃度17β-E2則通過(guò)影響B(tài)ax蛋白的表達(dá)選擇性誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞的凋亡。周期分布可直接反映細(xì)胞的增殖情況。

該研究利用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)觀察17β-E2對(duì)SiO2誘導(dǎo)的L929細(xì)胞增殖的影響，篩選出20 mg/L SiO2誘導(dǎo)24 h，然后用10－6mol/L 17β-E2 干預(yù)24 h的實(shí)驗(yàn)條件。然后，在該實(shí)驗(yàn)條件下，作者觀察了L929細(xì)胞周期分布的變化。結(jié)果顯示，SiO2誘導(dǎo)組小鼠肺成纖維細(xì)胞G1期細(xì)胞比例較空白對(duì)照組降低，S+G2期細(xì)胞比例升高;而17β-E2干預(yù)組G1期細(xì)胞比例較SiO2誘導(dǎo)組升高，S+G2期細(xì)胞比例降低。上述結(jié)果提示17β-E2可以提高肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞的比例，減少S期和G2期細(xì)胞的比例，有效阻抑細(xì)胞由G1期進(jìn)入G2和S期，從而抑制小鼠肺成纖維細(xì)胞的增殖。

[1]張勤勤，孫潤(rùn)廣，李連啟.Caveolae及其蛋白家族的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的研究現(xiàn)狀[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程，2011，30(2):215

[2]Liu HM，Zhao XF，Guo LN，et al.Effects of caveolin-1 on the 17 beta-estradiol-mediated inhibition of VSMC proliferation induced by vascular injury[J].Life Sci，2007，80(8):800

[3]鄧振偉，于萍，陳玲.SPSS軟件在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果分析中的應(yīng)用[J].電腦學(xué)習(xí)，2009(5):15

[4]鮑榮輝，劉先哲，周軍.人成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，28(5):577

[5]朱蘭，馮莉，伊雪，等.SiO2對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1和肺成纖維細(xì)胞Ⅲ型膠原表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38(14):2797

[6]劉清華，董國(guó)芳，盛穎，等.生理劑量的雌激素對(duì)雌、雄性大鼠肝纖維化形成的影響[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19(1):14

[7]王林金，陳茂偉.Caveolin-1蛋白對(duì)肝細(xì)胞癌ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29(2):210

[8]Ali WW，李世文，羅儀，等.不同濃度雌激素對(duì)大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡的影響[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，29(6):712