高效液相色譜法同時測定膀胱鏡膠中利多卡因與羥苯乙酯的含量*

王華棟，于 斐，劉向輝，湯曉陽，吳擁軍#

1)河南省醫(yī)療器械檢驗所 鄭州 450003 2)鄭州大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生化學教研室 鄭州 450001

膀胱鏡膠主要用于配套膀胱鏡臨床診斷。在實施膀胱鏡檢查前，將膀胱鏡膠涂抹在膀胱鏡前端起潤滑導入作用。膀胱鏡膠中常含有二甲基硅油、利多卡因、羥苯乙酯等成分。利多卡因起局部麻醉作用，例如無痛人工流產(chǎn)中的宮腔表面麻醉[1]，可降低患者黏膜敏感度、減輕疼痛。利多卡因在劑量較大時可能會引起眩暈、驚厥、呼吸抑制等神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)[2]，也可能對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生傷害，甚至引起過敏性休克導致死亡[3]。羥苯乙酯屬于羥苯烷基酯類防腐劑，具有抑菌力強、毒性低和無刺激性的特點。羥苯乙酯用量不足時，達不到有效抑菌濃度;用量過大，又易引起不良反應(yīng)。因此有必要對膀胱鏡膠中利多卡因和羥苯乙酯的含量進行測定以控制產(chǎn)品質(zhì)量。目前報道的利多卡因的分析方法有分光光度法[4]、液相色譜法[5]、化學發(fā)光法[6]等，羥苯乙酯的測定方法有分光光度法[7]、液相色譜法[8]等，但尚無同時測定膀胱鏡膠中利多卡因和羥苯乙酯的報道。該研究采用高效液相色譜法同時測定了膀胱鏡膠中利多卡因和羥苯乙酯的含量，報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 熱電U3000液相色譜儀(配紫外檢測器和自動進樣器)，賽多利斯BP211電子天平，PE Lambda 35紫外可見分光光度計。利多卡因?qū)φ掌?100342-201003)與羥苯乙酯對照品(100847-201102)均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純;膀胱鏡膠樣品由江西某廠提供。

1.2 溶液制備

1.2.1 對照品儲備溶液的制備 精密稱取利多卡因?qū)φ掌?0 mg，置10 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為利多卡因?qū)φ掌穬淙芤?。精密稱取羥苯乙酯對照品50 mg，置50 mL量瓶中，同上處理制備羥苯乙酯對照品儲備溶液。用前稀釋至所需濃度。

1.2.2 供試品溶液和空白溶液的制備 精密稱取膀胱鏡膠2.5 g，置50 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。取按照產(chǎn)品配方配制的不含利多卡因和羥苯乙酯的空白樣品，同法制備空白溶液。

1.2.3 磷酸鹽緩沖液的制備 取0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液28 mL、0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液72 mL，加超純水稀釋至1 L，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.2備用。

1.3 色譜條件 色譜柱:DIONEX Acclaim PA2色譜柱(250.0 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.2)-甲醇，體積比 350∶650;流速:1 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:256 nm(羥苯乙酯)和220 nm(利多卡因);進樣體積:10 μL。

1.4 線性關(guān)系考察 取1.2.1項下2對照品儲備溶液，用流動相逐級稀釋為5個濃度梯度的混合對照品溶液，其中分別含利多卡因100.8～1008.0 mg/L和羥苯乙酯20.0～200.6 mg/L。按上述色譜條件分別進樣10 μL，記錄2成分峰面積，以濃度為橫坐標，以相應(yīng)成分的峰面積為縱坐標進行線性回歸。

1.5 系統(tǒng)適用性及專屬性考察 取1.2.1項下2對照品儲備溶液各1 mL，用流動相稀釋至50 mL作為系統(tǒng)適用性溶液。按1.3色譜條件進樣10 μL，分別計算利多卡因和羥苯乙酯的理論塔板數(shù)、2峰分離度和不對稱度。

分別取系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液和空白溶液，按1.3色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖。觀察配方中其他成分在利多卡因和羥苯乙酯峰位置有無吸收，確定該方法的專屬性。

1.6 回收率實驗 取供試品按照低、中、高3個濃度添加對照品溶液，稀釋至線性范圍內(nèi)。按1.3色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖。平行測定3次，按外標法以峰面積作為供試品溶液和3個濃度梯度加標溶液中利多卡因和羥苯乙酯的含量，計算回收率。

1.7 進樣重復(fù)性與方法精密度實驗

1.7.1 進樣重復(fù)性 取膀胱鏡膠1支，按1.2.2方法制備供試品溶液，按1.3色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖。平行測定6次，計算2成分含量的RSD。

1.7.2 方法精密度 取同批號膀胱鏡膠6支，按1.2.2方法平行制備6份供試品溶液，按1.3色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖，分別測定。計算2成分含量的RSD。

1.8 靈敏度實驗 按1.2.1方法制備對照品溶液，逐級稀釋，按1.3色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖。將相應(yīng)峰高為儀器噪音3倍峰高作為檢出限(S/N≥3)。

按1.2.1方法制備對照品溶液，逐級稀釋，按1.3色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖。將相應(yīng)峰高為儀器噪音10倍峰高作為定量限(S/N≥10)。

1.9 穩(wěn)定性實驗 按1.2方法配制對照品溶液和供試品溶液，按1.3色譜條件，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，每隔2 h進樣1次，共進樣6次，分別根據(jù)峰面積計算出濃度，由濃度求出RSD。

1.10 樣品測定 取3批膀胱鏡膠，按1.2.2方法配制樣品溶液，在1.3色譜條件下分別進樣10 μL，平行測定3次，先計算出樣品中2成分實際含量，然后計算實際含量占標示量的百分比。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性及專屬性 理論塔板數(shù)按利多卡因峰計算為13526，按羥苯乙酯峰計算為11000。2峰分離度大于10.0;不對稱度 1.12 ～1.20。

配方中其他成分在利多卡因和羥苯乙酯峰位置均無吸收，表明該方法專屬性良好(圖1A、B)。

圖1 膀胱鏡膠中利多卡因和羥苯乙酯測定色譜圖

2.2 線性關(guān)系結(jié)果 回歸方程:Y=0.3321X+1.8462，r=0.9997(利多卡因);Y=0.7714X+0.1020，r=0.9995(羥苯乙酯)。

2.3 回收率實驗結(jié)果 見表1。

2.4 進樣重復(fù)性與方法精密度實驗結(jié)果

2.4.1 重復(fù)性 利多卡因和羥苯乙酯含量的RSD分別為0.58%和0.31%。

2.4.2 精密度 利多卡因和羥苯乙酯含量的RSD分別為0.73%和0.30%。

2.5 靈敏度實驗結(jié)果 以儀器噪音3倍峰高作為檢出限，測得利多卡因的最小檢出限為0.4 mg/L，羥苯乙酯的最小檢出限為0.03 mg/L。以儀器噪音10倍峰高作為定量限，測得利多卡因的定量限為0.8 mg/L，羥苯乙酯的定量限為 0.16 mg/L。

表1 回收率實驗結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性實驗結(jié)果 12 h內(nèi)，對照品溶液RSD為0.55%(利多卡因)、0.33%(羥苯乙酯)，樣品溶液 RSD 為 0.62%(利多卡因)、0.30%(羥苯乙酯)，表明對照品溶液和樣品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品測定結(jié)果 見表2。

表2 膀胱鏡膠中利多卡因和羥苯乙酯測定結(jié)果(n=3) mg/L

3 討論

3.1 流動相組成 實驗中對流動相的組成進行了篩選，分別采用乙腈-水、乙腈-體積分數(shù)0.1%磷酸水溶液、甲醇-磷酸鹽緩沖液、乙腈-磷酸鹽緩沖液作為流動相。發(fā)現(xiàn)流動相pH值對2種被測成分出峰情況均有影響。酸性條件下，利多卡因峰拖尾嚴重，且出峰過快，而羥苯乙酯峰保留時間超過25 min，峰明顯展寬;pH值提高后，利多卡因的峰形有改善，羥苯乙酯的保留時間縮短。經(jīng)過優(yōu)化有機相和緩沖鹽的比例，采用1.3中的流動相配比，2成分峰形良好，分離度滿足要求。

3.2 檢測波長的選擇 以流動相為空白對照，用紫外可見分光光度計分別對2成分在200～400 nm范圍內(nèi)進行了掃描，發(fā)現(xiàn)利多卡因在210 nm處吸光度最大，從210～260 nm吸光度逐漸下降;羥苯乙酯的最大吸收峰在256 nm，其他波長處吸光度較低?？紤]到有機相為甲醇，選擇220 nm為利多卡因的檢測波長，256 nm為羥苯乙酯的檢測波長。作者比較了分別使用單一波長(256或220 nm)對同一份對照品溶液進行測定后獲取的2張色譜圖，利多卡因峰在256 nm測定時峰高大約為220 nm時的1/20;羥苯乙酯峰在256 nm測定時峰高大約為220 nm時的2.5倍。為了使2成分均可獲得最高的檢測靈敏度，在分析過程中切換檢測波長為相應(yīng)被測物的檢測波長。具體設(shè)置為:設(shè)置初始波長為256 nm直至羥苯乙酯出峰完全，然后將檢測波長切換至220 nm測定利多卡因;待利多卡因測定完成后再將波長切回256 nm。

總之，作者建立了一種同時測定膀胱鏡膠中利多卡因和羥苯乙酯含量的分析方法;該方法操作簡便、準確、重復(fù)性好，樣品溶液穩(wěn)定，可用于該類產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

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