睪酮對血管緊張素Ⅱ誘導的乳鼠心肌成纖維細胞增殖和膠原合成的影響*

孫麗娜，王 穎#，燕樹勛，張彥周，魏子涵，秦 鵬，孫素珂

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科 鄭州 450052 2)河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450008 3)鄭州大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 450052 4)河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CF)是心肌組織中含量最多的細胞，占60% ～70%，在維持心臟正常結構和功能方面起重要作用[1-2]。在各種致病因素的作用下，心肌間質(zhì)CF增多，將導致膠原合成增加并過度沉積、基質(zhì)蛋白合成增多，最終導致心肌纖維化[3]。心肌纖維化是高血壓、冠心病、心力衰竭等心血管疾病心肌重構發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[3]。導致心肌纖維化的因素很多，已知腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)的過度激活是導致心肌纖維化的重要因素之一。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是RAS中重要的生物學效應分子[4]，可刺激膠原合成，誘導CF增殖，在心肌纖維化、高血壓、動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[5]。近年來研究[6-7]顯示睪酮對心血管系統(tǒng)有保護作用，但其機制尚不清楚。作者用AngⅡ誘導乳鼠CF，觀察睪酮對誘導細胞的細胞周期、膠原合成和ERK1/2蛋白磷酸化的影響，為睪酮應用于冠心病心肌纖維化、心室重構的預防及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，新生胎牛血清(杭州四季青公司)，AngⅡ、碘化丙啶(PI)、RNA 酶、睪酮(美國 Sigma公司)，Triton(Amresco公司)，磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗體(美國Cell Signaling公司)，胰蛋白酶(Difco公司)，Ⅱ型膠原酶(Invitrogen公司)，VG染色試劑盒(北京世劑合力公司)，免疫組化試劑盒、鼠抗波形蛋白單克隆抗體及對氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術服務有限公司)，其他試劑為市售分析純。

電熱恒溫干燥箱(上海瀘南科學儀器廠，202-1型)，流式細胞儀(COULTER Epics-XP-MCL公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國熱電Scientific公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，CK2型)，低溫高速離心機(德國Heraeus公司，Biofuge28RS型)。

1.2 乳鼠CF的原代提取、傳代培養(yǎng)及鑒定 1 d齡Wistar乳鼠20只，雌雄不限，由鄭州大學實驗動物中心提供，動物編號:0008508。無菌條件下開胸取出心臟，取左心室，將其剪成1 mm3大小的碎塊，反復沖洗，加入0.8 g/L胰蛋白酶、0.1 g/LⅡ型膠原酶消化10 min，反復多次，直至組織塊消失，收集每次消化液，離心棄上清，加入含體積分數(shù)20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，置于體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。根據(jù)心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同，差速貼壁2 h，棄上清，待細胞長滿瓶壁后用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。實驗采用第2～3代的細胞，細胞經(jīng)鼠抗波形蛋白免疫細胞化學染色鑒定為CF。

1.3 實驗分組 實驗分4組，分別用無血清DMEM培養(yǎng)液(對照組)、含 10－6mol/L AngⅡ的無血清DMEM培養(yǎng)液(AngⅡ組)、含30 nmol/L睪酮的無血清DMEM培養(yǎng)液(睪酮組)、含30 nmol/L睪酮和10－6mol/L AngⅡ的無血清DMEM培養(yǎng)液(睪酮+AngⅡ組)培養(yǎng)。

1.4 觀察指標

1.4.1 細胞周期分布 分組培養(yǎng)24 h后，收集細胞，以體積分數(shù)70%的乙醇固定，離心去固定液，加入 500 μL PI綜合染液(PI 5 mg，RNA 2 mg，體積分數(shù)1%Triton 0.25 mL，生理鹽水65 mL，加蒸餾水至100 mL，pH 為7.2 ～7.6)室溫染色 30 min 后，上流式儀檢測。重復3次。

1.4.2 膠原含量 制備CF爬片，待細胞連接成片后，分組培養(yǎng)24 h，傾去培養(yǎng)基，沖洗，行蘇木素染色，沖洗，滴加VG工作液染色，分化、脫水、透明、封片。切片于倒置相差顯微鏡下觀察并攝片，使用Biosins Digital Imaging Systems測定染色區(qū)域積分光密度值，以此表示膠原含量。重復3次。

1.4.3 p-ERK1/2的表達 制備 CF爬片，待細胞連接成片后，分組培養(yǎng)30 min，免疫細胞化學染色法測定p-ERK1/2。p-ERK1/2抗體稀釋200倍，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。切片于倒置相差顯微鏡下觀察并攝片，采用Biosins Digital Imaging Systems測定染色區(qū)域積分光密度值，以此表示p-ERK1/2的表達水平。重復3次。

1.5 統(tǒng)計學處理 用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，采用2×2析因設計的方差分析比較4組S期細胞比例、膠原含量和p-ERK1/2表達水平，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CF的鑒定 99%以上的細胞波形蛋白陽性表達(圖1)，提示CF分離培養(yǎng)成功。

圖1 CF的鑒定(SP，×400)

2.2 4組S期細胞比例的比較 見表1。AngⅡ組S期細胞比例較對照組和睪酮組增加，而睪酮+AngⅡ組S期細胞比例較AngⅡ組明顯降低。

表1 4組S期細胞比例的比較(n=3) %

2.3 4組膠原含量和p-ERK1/2表達的比較 見圖2、3 及表 2、3。

圖2 4組膠原的表達(VG染色法，×200)

圖3 4組p-ERK1/2的表達(SP，×200)

表2 4組膠原含量的比較(n=3)

表3 4組p-ERK1/2表達水平的比較(n=3)

3 討論

心肌纖維化主要表現(xiàn)為CF增殖、Ⅰ型和Ⅲ型膠原沉積、細胞外基質(zhì)蛋白集聚等[8]，是臨床多種心臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎，可致心力衰竭、心律失常、心源性猝死等嚴重并發(fā)癥[9]。AngⅡ通過與細胞上受體結合，經(jīng)細胞內(nèi)信號轉導通路的級聯(lián)反應，最終促進CF生長及胞外基質(zhì)蛋白的表達，在心肌重構中發(fā)揮重要作用[4]。

睪酮是類固醇激素，是男性體內(nèi)最重要的雄激素，在維持男性性征、免疫功能等方面起重要作用。自1990年研究發(fā)現(xiàn)睪酮對心血管系統(tǒng)有影響后，有關睪酮在心血管疾病影響方面的研究逐漸增多，但目前國內(nèi)外相關研究結果并不一致。已證實[9-10]血清睪酮水平降低與心血管事件的發(fā)生正相關。外源性睪酮與心血管不良事件有關[11]。有研究[12]發(fā)現(xiàn)睪酮對心血管系統(tǒng)有保護作用，如抗炎、調(diào)節(jié)血脂[13]、減輕動脈粥樣硬化、擴張血管、保護 AngⅡ誘導的血管重塑等[14]。

絲裂素活化蛋白激酶系統(tǒng)(MAPKs)是多種胞外信號向胞內(nèi)信號傳遞的匯聚點和共同通路，是參與AngⅡ生物學效應的重要信號轉導通路之一，目前已經(jīng)確定有 3條 MAPKs亞通路，ERK1/2是MAPKs亞通路之一，而p-ERK1/2為ERK1/2的活性形式[15]。該研究中，作者觀察到，10－6mol/L AngⅡ能明顯增加CF的S期(DNA合成期)細胞比例及膠原合成，同時能明顯增強p-ERK1/2的表達，提示AngⅡ能促進CF的增殖，且該效應可能通過ERK1/2通路實現(xiàn)，這與以往的研究[3-4，16]結果相符。作者還觀察到，睪酮+AngⅡ組CF的S期細胞比例及膠原合成較AngⅡ單獨作用組明顯下降，p-ERK1/2的表達亦顯著降低，提示睪酮可抑制AngⅡ誘導的CF增殖及膠原合成，其機制可能與抑制ERK1/2的活化有關。

綜上所述，離體情況下睪酮可抑制AngⅡ誘導的CF的增殖及膠原合成，從而在抑制心肌纖維化中發(fā)揮重要作用，該抑制作用可能與抑制ERK1/2信號通路有關。

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