胃腺癌組織中Lgr5和Wnt1蛋白的表達(dá)

張曉峰，張連峰，程 鵬

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

胃癌起源于胃黏膜上皮細(xì)胞，在胃的各個(gè)部位均可發(fā)生。胃癌在世界范圍內(nèi)居腫瘤發(fā)病率的第4位，腫瘤死亡率的第2位[1]。中國是胃癌發(fā)病率和死亡率較高的國家之一。近年來腫瘤干細(xì)胞理論受到人們越來越多的關(guān)注。該理論認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是原發(fā)性腫瘤組織中一類具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細(xì)胞亞群，是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源[2]。Wnt信號通路參與組成干細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]。Wnt1為人類 Wnt基因家族中的第1個(gè)成員。研究[4]發(fā)現(xiàn)，多個(gè)生物學(xué)過程中存在Wnt1的異常、異位表達(dá)，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞的極性形成、細(xì)胞遷移和增殖，表明Wnt1與人類多個(gè)系統(tǒng)腫瘤密切相關(guān)。作為Wnt信號通路的靶基因，G蛋白偶聯(lián)受體Lgr5主要表達(dá)于肌肉、胎盤、脊髓、腦組織中。近年研究[5]發(fā)現(xiàn)Lgr5為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物之一，在多種腫瘤組織中過表達(dá)[6]。作者在該研究中聯(lián)合檢測了胃腺癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織中Wnt1和Lgr5蛋白的表達(dá)，探討二者在胃腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床診斷、治療及判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年1月至2013年2月外科手術(shù)切除后的存檔石蠟標(biāo)本76例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理明確診斷為胃腺癌。76例患者中男47例，女29例;年齡29～78歲，中位年齡54歲;均接受胃癌根治術(shù)，術(shù)前均未行放、化療和生物免疫治療;分化程度:高、中分化腺癌31例，低分化腺癌45例;臨床分期:Ⅰ、Ⅱ期45例，Ⅲ、Ⅳ期31例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。同時(shí)取其中30例患者的癌旁正常胃組織作為正常對照。

1.2 Lgr5和Wnt1蛋白的免疫組化檢測 Lgr5和Wnt1兔抗人多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，即用型SP試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，高溫高壓修復(fù)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。Lgr5和Wnt1一抗均按1∶100稀釋，用PBS代替一抗作空白對照，用已知陽性切片作陽性對照。結(jié)果判斷:Lgr5陽性染色主要分布于胞膜或胞質(zhì)內(nèi)，可見均勻一致的棕色顆粒。每張切片選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，記錄其中的陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞百分比＜10%為陰性，≥10%為陽性。Wnt1陽性染色分布于細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色。每張切片選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性，≥5%為陽性。免疫組化染色結(jié)果由兩位高年資病理科醫(yī)師在雙盲條件下進(jìn)行評定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)比較胃腺癌和癌旁正常胃組織Lgr5和Wnt1蛋白表達(dá)的差異以及不同一般人口學(xué)特征及臨床病理特征的胃腺癌患者Lgr5和Wnt1蛋白表達(dá)的差異，采用列聯(lián)系數(shù)分析胃腺癌組織中Lgr5和Wnt1蛋白表達(dá)的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌組織及癌旁正常組織中Lgr5和Wnt1蛋白的表達(dá) 見圖1、表1。

2.2 不同一般人口學(xué)特征及臨床病理特征的胃腺癌患者Lgr5和Wnt1蛋白的表達(dá)比較 見表2。由表2可知，Lgr5和Wnt1的表達(dá)與患者的性別和年齡無關(guān)，與腫瘤的大小、TNM分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。

圖1 胃腺癌組織(A)及癌旁正常組織(B)中Lgr5和Wnt1蛋白的陽性表達(dá)(SP，×200)

表1 胃腺癌組織和癌旁正常胃組織中Lgr5、Wnt1蛋白的表達(dá)比較 陽性例數(shù)(%)

表2 不同一般人口學(xué)特征及臨床病理特征的胃腺癌患者Lgr5和Wnt1蛋白的表達(dá)比較 陽性例數(shù)(%)

2.3 胃腺癌組織中Lgr5和Wnt1蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 見表3。胃腺癌組織中Lgr5和Wnt1蛋白的表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)。

表3 胃腺癌組織中Lgr5和Wnt1蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 例

3 討論

腫瘤干細(xì)胞具有無限增殖潛能決定著腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療失敗的根源。Wnt信號通路廣泛作用于機(jī)體生長發(fā)育過程，參與人體的胚胎發(fā)育、干細(xì)胞的增殖分化以及腫瘤的形成[7]。G蛋白偶聯(lián)受體Lgr5是Wnt信號通路的靶基因，為近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物之一。Lgr5蛋白由907個(gè)氨基酸組成，含有17個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的外功能區(qū)為其特征性結(jié)構(gòu)。Becker等[8]發(fā)現(xiàn)，正常胃腸組織中Lgr5的表達(dá)僅僅局限于隱窩基底部，即腸干細(xì)胞巢內(nèi);而在癌前病變組織中，Lgr5的表達(dá)明顯升高，并且陽性表達(dá)的細(xì)胞并不局限于隱窩基底部，這一結(jié)果表明腫瘤形成和惡變的早期事件是Lgr5陽性細(xì)胞離開干細(xì)胞巢，因此Lgr5在腫瘤的發(fā)生過程中可能有重要作用。Tanese等[9]發(fā)現(xiàn)Lgr5與基底細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前多認(rèn)為干細(xì)胞的Wnt信號通路異常激活后，引起靶基因lgr5的表達(dá)升高，可促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化和惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤的形成。該研究結(jié)果顯示Lgr5在癌旁正常胃黏膜少量散在表達(dá)，主要分布在胃腺體的底部及頸峽部，而在胃癌組織中，Lgr5的表達(dá)升高，并隨著分化程度的降低、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移以及浸潤范圍和深度的加大加深而升高。目前對Lgr5在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、干細(xì)胞的激活和腫瘤形成等過程中的具體作用機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

Wnt1為Wnt基因家族中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)成員。1982年首先從小鼠乳癌組織中克隆出這種基因。人類Wnt1基因定位于12q12～12q13，共編碼370個(gè)氨基酸序列。Wnt通路是一種對細(xì)胞增殖和分化具有重要調(diào)節(jié)作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，有多種分子參與并相互影響及制約[10]。Wnt1作為此通路中的重要成員之一，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的始動(dòng)因子;由于它在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等重要的病理生理過程中扮演著關(guān)鍵角色，所以目前受到廣泛關(guān)注。研究[11]發(fā)現(xiàn)在Wnt通路中，Wnt1蛋白分泌后作用于細(xì)胞表面基質(zhì)及其特異性受體卷曲蛋白，再經(jīng)其下游散亂蛋白磷酸化和去磷酸化過程來完成Wnt信號傳遞，組成Wnt途徑。很多腫瘤的發(fā)生與Wnt信號異常相關(guān)，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中也不乏Wnt信號通路異常的報(bào)道[12]。該研究結(jié)果顯示W(wǎng)nt-1蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，并且Wnt1在胃癌組織中的表達(dá)與癌組織分化程度、大小、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與既往相關(guān)研究[13-14]結(jié)果相似。因此Wnt-1可以作為評價(jià)胃癌生物學(xué)行為較好的指標(biāo)，同時(shí)也為抗癌藥物的研究提供了新靶點(diǎn)。

此外，該研究結(jié)果還顯示，作為Wnt信號通路的靶基因和參與經(jīng)典Wnt信號通路的重要成員，Lgr5和Wnt1關(guān)系密切，推測二者在胃癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中可能具有協(xié)同作用。尋找敏感的、特定的腫瘤分子標(biāo)志物在臨床腫瘤研究中仍是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)，尤其針對胃癌臨床預(yù)后差這一事實(shí)[15]。Lgr5和Wnt1有望為胃癌的早期診斷和基因治療提供新的切入點(diǎn)。

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