發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核蛋白的原核表達(dá)與鑒定*

胡小寧，黃學(xué)勇，杜燕華，尤愛(ài)國(guó)，許汴利#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 2)河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病防治所 鄭州 450016

發(fā)熱伴血小板減少綜合征是近年來(lái)發(fā)生在我國(guó)河南、湖北、山東等地區(qū)的一種新發(fā)傳染病，2010年河南信陽(yáng)報(bào)道“蜱咬人致死”事件后，該病備受各界關(guān)注。研究[1-2]證實(shí)發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)是引起該綜合征的病原體。SFTSV屬于布尼亞病毒科白蛉熱病毒屬，與其他布尼亞病毒科病毒相類似，其基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個(gè)單股負(fù)鏈RNA組成;其中S片段屬于雙義RNA，分別編碼核蛋白(nucleocapsid protein，NP)和非結(jié)構(gòu)蛋白[3-4]。在布尼亞病毒感染的臨床病例中，病毒NP是主要的免疫原，患者體內(nèi)相應(yīng)的抗體水平較高[5-6]。目前以部分布尼亞病毒科病毒NP作為目標(biāo)抗原的檢測(cè)試劑已廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，如裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV) 等[5，7]。該研究擬構(gòu)建SFTSV NP的原核表達(dá)載體并表達(dá)、純化，獲取具有抗原性的重組NP;以純化的NP作為診斷抗原，建立檢測(cè)血清樣本中NP抗體的ELISA檢測(cè)方法，為后續(xù)血清學(xué)檢測(cè)試劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、毒株和標(biāo)本 菌株E.coli JM109和克隆載體pMD18-T購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，原核表達(dá)載體pMAL-c2x、SFTSV毒株SH105均由鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室保存。體檢健康人血清(48份)和信陽(yáng)SFTSV流行區(qū)臨床診斷為SFTSV感染者急性期血清(96份)標(biāo)本由該教研室保存。

1.2 主要試劑和儀器 RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，SFTSV RNA檢測(cè)試劑盒(RT-PCR熒光探針?lè)?購(gòu)自北京華大吉比愛(ài)生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ以及其他酶類均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，膠回收試劑盒購(gòu)自杭州艾斯進(jìn)公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，IPTG、X-Gal、NC 膜、鼠抗人 IgG、HRP 標(biāo)記羊抗人IgM以及TMB底物、顯色試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、蛋白半干轉(zhuǎn)膜儀、酶標(biāo)儀均購(gòu)自BIO-RAD公司，Amylose樹脂預(yù)裝柱、蛋白純化儀均購(gòu)自GE公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì) 參照 BX-2010/Henan/CHN strain河南分離株HQ642768.1基因組序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)針對(duì)NP基因的PCR上游引物序列(NK1-1:5'-GCTCTAGAATGTCAGAGTGGTCCAGAAT-3')和下游引物序列(NK1-2:5'-CGCAAGCTTTTACAGGT TCCTGTAAGCAG-3')，分別在上、下游引物序列引入XbaⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 NP基因PCR擴(kuò)增 取SFTSV細(xì)胞培養(yǎng)物140 μL提取病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后通過(guò)PCR擴(kuò)增NP基因。50 μL的反應(yīng)體系中加入Extaq 25 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 1 μL，最后加不含RNase ddH2O至終體積。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以15 g/L瓊脂糖電泳鑒定。

1.5 NP原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基(氨芐青霉素 100 mg/L，IPTG 24 mg/L，X-Gal 40 mg/L)，于37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜。挑選陽(yáng)性單克隆菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定并送至南京金斯瑞科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。分別將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pMAL-c2x經(jīng)XbaⅠ、HindⅢ雙酶切后回收目的片段，回收產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中。菌液提取質(zhì)粒后酶切鑒定。

1.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 取酶切鑒定正確的菌液按1∶100體積比接種于LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素100 mg/L)，37℃振蕩培養(yǎng)至OD≈0.5時(shí)，加入不同濃度的IPTG(0.8和1.0 mmol/L)分別誘導(dǎo)培養(yǎng) 3.0、3.5、4.0、4.5 h 以確定蛋白適宜表達(dá)條件。在優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件下大量誘導(dǎo)表達(dá)菌液200 mL，離心收集菌體于－40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western blot分析 將誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物于室溫融化，加入10 mL PBS重懸浮，離心棄上清后加10 mL過(guò)柱緩沖液(20 mmol/L Tris-HCL，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DDT，pH=7.4)冰浴超聲 10 min。4 ℃8000 g離心5 min后分別取上清和沉淀行SDSPAGE，電泳后考馬斯亮藍(lán)R250染色并觀察。超聲后的上清液經(jīng)0.22 μm濾紙過(guò)濾并過(guò)Amylose樹脂預(yù)裝柱(按儀器操作步驟進(jìn)行)，最后用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCL，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L maltose，1 mmol/L DDT，pH=7.4)洗脫收集蛋白，SDS-PAGE觀察純化結(jié)果。電泳后將純化蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂牛奶封閉1 h;封閉后加入SFTSV急性期患者血清(按1∶50稀釋)孵育1 h，同時(shí)以健康人血清作為對(duì)照;加堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的鼠抗人IgG(按1∶1000稀釋)孵育1 h顯色觀察。

1.8 ELISA方法的建立與檢測(cè)效果的評(píng)價(jià) 用包被緩沖液將純化的 NP稀釋至10 mg/L，每孔150 μL包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，PBST洗滌3次;加入150 μL 封閉液37 ℃封閉2 h，加入100 μL 待測(cè)血清(按1∶10稀釋)37℃孵育30 min;洗板后加入100 μL HRP標(biāo)記羊抗人 IgM(按1∶1000稀釋)，37℃反應(yīng)30 min;每孔分別加入底物TMB溶液和顯色液50 μL，37℃反應(yīng)10 min;最后加入終止液50 μL。酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定OD值。對(duì)48例健康人血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，以P/N≥2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)值，以建立的ELISA法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(逆轉(zhuǎn)錄50℃30 min;95℃預(yù)變性15 min;95℃變性15 s，60℃退火40 s并收集FAM熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35為陽(yáng)性)同時(shí)對(duì)96份SFTSV感染者樣本進(jìn)行檢測(cè)，確定ELISA方法的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增 測(cè)序結(jié)果顯示，SFTSV NP的基因長(zhǎng)度為738 bp。該基因與GenBank上Orthobunyavirus 69號(hào)分離株(登錄號(hào)JF682778.1)的NP基因序列完全相同。

2.2 重組表達(dá)載體 pMAL-c2x-NP的鑒定pMAL-c2x-NP小提質(zhì)粒后經(jīng)XbaⅠ、HindⅢ雙酶切獲得結(jié)果相一致的目的條帶(圖1)，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白的表達(dá)、純化和Western blot分析不同濃度的IPTG均可誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，融合蛋白的表達(dá)量有所增加，表達(dá)量差異并不明顯(圖2)。該實(shí)驗(yàn)選取IPTG終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4 h。融合蛋白的可溶性結(jié)果分析顯示，目的蛋白雖然主要以包涵體形式表達(dá)，但上清中可溶性重組蛋白含量可滿足通過(guò)Amylose樹脂預(yù)裝柱純化的需要(圖3)。Western blot結(jié)果顯示SFTSV感染者血清與融合蛋白在約70000處有一條特異雜交帶，融合蛋白對(duì)識(shí)別SFTSV感染者血清具體良好的特異性(圖4)。

圖1 pMAL-c2x-NP的酶切鑒定結(jié)果

圖2 不同誘導(dǎo)條件下pMAL-c2x-NP的表達(dá)

圖3 重組蛋白的可溶性分析結(jié)果

圖4 純化融合蛋白的Western blot分析

2.4 ELISA方法的檢測(cè)效果 48份健康人血清抗NP抗體OD值的平均值=0.099。以建立的方法對(duì)96例臨床診斷SFTSV急性期患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為40.6%(39/96);實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè)的陽(yáng)性率為55.2%(53/96)。兩者符合率為77.1%，一致性檢驗(yàn)較好，見(jiàn)表1。

表1 2種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的一致性檢驗(yàn)

3 討論

近年來(lái)，蟲媒病毒嚴(yán)重威脅著人類的健康[8]。作為一種蜱傳新發(fā)傳染病，目前已建立多種針對(duì)SFTSV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，包括病毒分離、RT-PCR、IFA以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等[9-10]，而上述方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)人員都有較高的要求。血清學(xué)的檢測(cè)既能彌補(bǔ)基層實(shí)驗(yàn)條件的不足，又可用于流行病學(xué)調(diào)查。NP在病毒顆粒內(nèi)通過(guò)與病毒基因組RNA和RNA聚合酶結(jié)合形成NP體(ribonucleoprotein，RNP)，同時(shí)又具有同型寡聚化和RNA結(jié)合的特性，這些特性使得NP在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過(guò)程中起著重要的作用。針對(duì)SFTSV構(gòu)建的合成噬菌體抗體庫(kù)的研究[11]表明，94種人源多克隆抗體均可識(shí)別SFTSV的NP，而不與外膜蛋白發(fā)生反應(yīng)。研究[12]也顯示利用SFTSV感染者血清檢測(cè)NP的病毒顆粒和重組蛋白，結(jié)果均呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，而其他的靶標(biāo)蛋白如外膜蛋白等結(jié)果具有不穩(wěn)定性，可見(jiàn)NP特異性抗體在SFTSV感染者血清中的表達(dá)水平較高。針對(duì)NP的單克隆抗體研究[13-14]也顯示在檢測(cè)臨床病例中NP較高的親和力與高度的特異性，這些都證明NP在SFTSV早期診斷過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。而河南、山東、湖北等地發(fā)現(xiàn)的SFTSV基因組序列高度同源，這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的廣泛應(yīng)用提供了保障。

有研究[15]利用pEASY-E1表達(dá)系統(tǒng)獲取蜱傳森林腦炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。該實(shí)驗(yàn)采用的原核表達(dá)載體pMAL-c2x含有強(qiáng)啟動(dòng)子tac，可以高效表達(dá)外源蛋白。作者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)上清中融合蛋白的表達(dá)量完全可滿足純化的需要，這可能是該載體具有E.coli malE翻譯起始信號(hào)，可引導(dǎo)融合蛋白穿過(guò)胞質(zhì)膜進(jìn)入周質(zhì)有關(guān)。MBP的相對(duì)分子質(zhì)量為42000，因此NP的相對(duì)分子質(zhì)量大約在28000，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致。利用該蛋白構(gòu)建的ELISA檢測(cè)方法和實(shí)時(shí)熒光定量法對(duì)臨床血清樣本檢測(cè)的結(jié)果符合率為77.1%。研究[16]顯示當(dāng)血清樣本采樣時(shí)間小于3 d時(shí)，僅能通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè);同時(shí)由于ELISA方法在實(shí)驗(yàn)條件方面還需進(jìn)一步優(yōu)化，這可能是兩者結(jié)果差異的原因。

該研究通過(guò)構(gòu)建SFTSV NP基因的原核表達(dá)載體，優(yōu)化融合蛋白的表達(dá)條件，經(jīng)過(guò)親和層析后獲得純化的重組融合蛋白。經(jīng)Western blot證實(shí)該融合蛋白具有抗原性，用建立的ELISA方法對(duì)臨床樣本做了初步檢測(cè)，為后續(xù)的SFTSV血清學(xué)檢測(cè)試劑的研發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

[1]Xu B，Liu L，Huang X，et al.Metagenomic analysis of fever，thrombocytopenia and leukopenia syndrome(FTLS)in Henan Province，China:discovery of a new bunyavirus[J].PLoS Pathog，2011，7(11):e1002369

[2]Yu XJ，Liang MF，Zhang SY，et al.Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China[J].N Engl J Med，2011，364(16):1523

[3]許汴利.新布尼亞病毒感染致發(fā)熱伴血小板減少綜合征的發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識(shí)與啟示[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，46(2):99

[4]李德新.發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒概述[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2011，25(2):81

[5]Fafetine JM，Tijhaar E，Paweska JT，et al.Cloning and expression of Rift Valley fever virus nucleocapsid(N)protein and evaluation of a N-protein based indirect ELISA for the detection of specific IgG and IgM antibodies in domestic ruminants[J].Vet Microbiol，2007，121(1/2):29

[6]Jansen van Vuren P，Potgieter AC，Paweska JT，et al.Preparation and evaluation of a recombinant Rift Valley fever virus N protein for the detection of IgG and IgM antibodies in humans and animals by indirect ELISA[J].J VirolMethods，2007，140(1/2):106

[7]Saijo M，Qing T，Niikura M，et al.Recombinant nucleoprotein-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection of immunoglobulin G antibodies to Crimean-Congo hemorrhagic fever virus[J].J Clin Microbiol，2002，40(5):1587

[8]徐志凱，戚中田，胡福泉，等.重要病原微生物研究進(jìn)展及展望[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，35(9):1061

[9]Sun Y，Liang M，Qu J，et al.Early diagnosis of novel SFTS bunyavirus infection by quantitative real-time RT-PCR assay[J].J Clin Virol，2012，53(1):48

[10]黃學(xué)勇，杜燕華，李幸樂(lè)，等.新布尼亞病毒IgG抗體間接免疫熒光檢測(cè)方法的建立[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，46(2):165

[11]Yu L，Zhang L，Sun L，et al.Critical epitopes in the nucleocapsid protein of SFTS virus recognized by a panel of SFTS patients derived human monoclonal antibodies[J].PLoS One，2012，7(6):e38291

[12]盧靜，李川，張福順，等.發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)研究[J].病毒學(xué)報(bào)，2011，27(6):515

[13]徐言，曾曉燕，焦永軍，等.發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核衣殼蛋白單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用[J].免疫學(xué)雜志，2012，28(4):282

[14]劉艷，金柯，韓亞萍，等.發(fā)熱伴血小板減少綜合征患者血清中核蛋白抗體的動(dòng)態(tài)變化[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13(18):3432

[15]宋天一，李菁華，張哲，等.蜱傳森林腦炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1原核表達(dá)載體的構(gòu)建[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，39(3):620

[16]杜燕華，黃學(xué)勇，王海峰，等.實(shí)時(shí)熒光PCR法與ELISA法在發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例檢測(cè)中的比較[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013，29(1):101