p16基因高表達(dá)對293細(xì)胞衰老的影響*

馬珊珊，劉 靜，姚 寧，崔淵博，邢 衢，王夢然，郭天宇，楊 波，關(guān)方霞1，

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450001 2)華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上海 200241 3)中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510275 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

衰老是機(jī)體的細(xì)胞、組織及器官在結(jié)構(gòu)和功能上逐漸出現(xiàn)的不可逆轉(zhuǎn)的全面退行性變化。目前研究[1]認(rèn)為，衰老是干細(xì)胞衰退、DNA退化、飲食及精神因素、衰老基因活躍等綜合作用的結(jié)果，但仍未形成統(tǒng)一的衰老理論。細(xì)胞衰老是受某些基因控制、借助于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的，其中P16/Rb和P53控制的信號(hào)途徑至關(guān)重要[2-4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，在衰老細(xì)胞中p16基因處于高表達(dá)水平。該研究首先構(gòu)建p16基因高表達(dá)載體，然后將高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，并觀察p16基因高表達(dá)對293細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及衰老的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 293細(xì)胞為鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存的人腎上皮細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代。

1.2 主要試劑 Trizol和Lipofectamine2000均購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和β-半乳糖苷酶染色試劑盒均購自TaKaRa公司，Western blot相關(guān)試劑和抗體均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.3 p16基因高表達(dá)載體的構(gòu)建 取對數(shù)生長期的293細(xì)胞，消化后離心，收集細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA模板。根據(jù)p16 mRNA序列(GenBank登錄號(hào)為:U26727.1)設(shè)計(jì)引物，RT-PCR擴(kuò)增p16基因ORF序列(上游引物為5'-GCCGGAAGCTTATG GTGCGCAGGTTCTTGGT-3'，下游引物為 5'-CTAAT GGTACCCAGCCAGGTCCACGGGCAGA-3'，下劃線堿基表示引入的酶切位點(diǎn))。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，4℃終止反應(yīng)。然后將擴(kuò)增片段酶切后插入到pEGFP-N1的HindⅢ和KpnⅠ位點(diǎn)之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒 pEGFPN1-p16ORF。

1.4 p16基因高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞 用Lipofectamine2000將p16基因高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。將293細(xì)胞分為3組:正常組、空質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1)、高表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pEGFPN1-p16ORF)，每組3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞均置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h之后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。

1.5 CCK-8法檢測p16基因高表達(dá)對293細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞分組及處理同1.4。各組細(xì)胞每天同一時(shí)間加入10 μL CKK-8溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測細(xì)胞在450 nm波長下的吸光度值，連續(xù)測6 d，記錄數(shù)據(jù)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 PI染色法檢測p16基因高表達(dá)對293細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞分組及處理同1.4。培養(yǎng)24 h后消化、收集各組細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106mL－1。取1 mL單細(xì)胞懸液，離心后去除上清，在細(xì)胞中加入2 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的冰乙醇固定過夜。用PBS洗去固定液，加入2.5 μL 10 g/L RNase A并置于37℃水浴30 min。避光加入PI染料，4℃30 min。上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.7 RT-PCR法檢測各組293細(xì)胞中p16和p21 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞分組及處理同1.4。首先采用Trizol法抽提各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用RT-PCR試劑盒并按說明進(jìn)行操作，采用β-actin作為內(nèi)參。引物序列見表1。反應(yīng)條件:95℃30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用比較CT法，mRNA相對表達(dá)量=2－ΔΔCT。

表1 引物序列

1.8 Western blot法檢測各組293細(xì)胞中P16和P21蛋白的表達(dá) 細(xì)胞分組及處理同1.4。收集3組細(xì)胞，提取總蛋白。加入適量蛋白抽提試劑，冰上孵育30 min，讓細(xì)胞充分裂解。蛋白樣品中加入5×上樣緩沖液，沸水中煮10 min，再迅速冰浴5 min，分裝后置于－20℃保存?zhèn)溆谩＝?jīng)SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜后于體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入鼠抗 P16一抗(1∶500稀釋)、P21一抗(1∶1000稀釋)過夜孵育，TBST洗膜3次，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗在室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影成像，最后用Image J圖像分析軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

1.9 各組293細(xì)胞β-半乳糖苷酶表達(dá)的檢測 細(xì)胞分組及處理同1.4。吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10 min。去除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min。然后每孔加入1 mL染色工作液，37℃孵育2 h。普通光學(xué)顯微鏡下觀察，藍(lán)染細(xì)胞為衰老細(xì)胞。100倍鏡下選取5個(gè)視野，觀察并計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3組間細(xì)胞周期分布、p16及p21 mRNA和蛋白相對表達(dá)量、β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 p16基因高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞 結(jié)果見圖1。

2.2 p16基因高表達(dá)對293細(xì)胞增殖的影響 各組293細(xì)胞生長曲線見圖2。

2.3 p16基因高表達(dá)對293細(xì)胞周期的影響 結(jié)果見表2。高表達(dá)組G0/G1期細(xì)胞增加，S期、G2/M期細(xì)胞減少。

圖1 各組293細(xì)胞GFP的表達(dá)(×100)

圖2 各組293細(xì)胞的生長曲線

表2 各組293細(xì)胞周期的變化 %

2.4 RT-PCR檢測各組293細(xì)胞中 p16和 p21 mRNA的表達(dá) 結(jié)果見表3。可知高表達(dá)組中p16和p21 mRNA的表達(dá)上升。

2.5 Western blot檢測各組293細(xì)胞中P16和P21蛋白的表達(dá) 結(jié)果見圖3和表4?？芍?，高表達(dá)組P16和P21蛋白的表達(dá)上升。

2.6 各組293細(xì)胞中β-半乳糖苷酶表達(dá)的檢測高表達(dá)組293細(xì)胞β-半乳糖苷酶的表達(dá)上升(圖4和表5)。

表3 各組293細(xì)胞中p16、p21 mRNA的表達(dá)

圖3 各組293細(xì)胞中P16和P21蛋白的表達(dá)

表4 各組293細(xì)胞中P16、P21蛋白的表達(dá)

圖4 各組293細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色情況(×40)

表5 各組293細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率 %

3 討論

Han等[7]研究發(fā)現(xiàn)P16蛋白能增加P21蛋白的穩(wěn)定性，P21蛋白則通過轉(zhuǎn)錄因子Sp1激活p16基因的表達(dá)，二者協(xié)同抑制細(xì)胞周期。細(xì)胞周期的停滯是細(xì)胞衰老的前提，細(xì)胞衰老伴隨著細(xì)胞形態(tài)的改變和相關(guān)基因表達(dá)的變化[6，8-10]。研究[11]表明利用脂質(zhì)體介導(dǎo)p16 cDNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入p16陰性的人紅白血病細(xì)胞株后，細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡率增加。該實(shí)驗(yàn)將p16基因高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，結(jié)果顯示p16基因高表達(dá)抑制了293細(xì)胞的增殖并將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，而且p16基因高表達(dá)可以上調(diào)細(xì)胞衰老相關(guān)基因 p21的表達(dá)，說明p16基因可能通過促進(jìn)p21基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞衰老。

細(xì)胞衰老的指標(biāo)中，除p21表達(dá)升高外，β-半乳糖苷酶的表達(dá)亦升高。有研究[12]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人二倍體成纖維細(xì)胞在pH為6時(shí)，其β-半乳糖苷酶陽性率隨著代齡增加而增加，因此β-半乳糖苷酶是目前公認(rèn)的檢測細(xì)胞衰老的金標(biāo)準(zhǔn)。該實(shí)驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)p16基因高表達(dá)載體導(dǎo)致293細(xì)胞中β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率上升，說明細(xì)胞已呈現(xiàn)衰老狀況。

總之，該研究說明p16基因在細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮調(diào)控作用，并初步建立了p16基因高表達(dá)的細(xì)胞衰老模型，為進(jìn)一步研究細(xì)胞衰老的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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