抗阻訓(xùn)練對老齡大鼠腓腸肌Ca2+及線粒體膜電位的影響*

王 震，林文弢，翁錫全，孟 艷，藺海旗

(1.廣東青年職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510507;2.廣州體育學(xué)院，廣東廣州 510500;3.華南理工大學(xué)體育學(xué)院，廣東廣州 510641)

線粒體是細(xì)胞氧化磷酸化的主要場所，為機(jī)體生命活動提供能量，貯存Ca2+、抗活性氧等重要生理作用。其功能異常、能量代謝障礙是引起細(xì)胞凋亡或壞死的原因之一。近年來，研究發(fā)現(xiàn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)是位于線粒體內(nèi)外膜之間的一種復(fù)合體蛋白，其開放狀態(tài)決定了線粒體膜電位(Δψm)的變化。人類和動物在衰老過程中，多數(shù)組織線粒體功能退化或出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致Δψm下降，產(chǎn)生的過氧化物增加，ATP合成減少［1］。同時(shí)，線粒體胞漿內(nèi)Ca2+濃度穩(wěn)定性減弱，代謝功能異常，線粒體鈣聚積，損害細(xì)胞的功能［2］。目前已有大量關(guān)于衰老與線粒體功能的報(bào)道，但有關(guān)抗阻訓(xùn)練對衰老機(jī)體線粒體Δψm變化報(bào)道較少。本文以18月齡雄性SD大鼠為研究對象，觀察8周抗阻訓(xùn)練后老齡大鼠腓腸肌Ca2+、Δψm變化，探討抗阻訓(xùn)練對老齡大鼠腓腸肌Δψm的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

11月齡健康雄性SD大鼠45只，體重600～1000g。購于廣東省生物醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號:SCXK(粵)2008－0002)，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，適量飲食(每籠每日90g)，室溫23±2℃。濕度40% ～60%，自然晝夜節(jié)律變化光照，定時(shí)換墊料和飲水，保持通風(fēng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

大鼠喂養(yǎng)7個(gè)月后，隨機(jī)分為安靜組、無負(fù)重訓(xùn)練組、30%最大負(fù)重訓(xùn)練組、50%最大負(fù)重訓(xùn)練組和70%最大負(fù)重訓(xùn)練組，每組8只。抗阻訓(xùn)練方式為尾巴負(fù)重跑臺爬坡，坡度為35°，跑速15m/min。具體訓(xùn)練方案見表1。

表1 老齡大鼠抗阻力量訓(xùn)練方案

1.3 樣品采集

抗阻訓(xùn)練完成后，大鼠均禁食約12h，稱體重，10%水合氯醛300mg/kg.wt腹腔注射麻醉，剖腹取血，即刻取出腓腸肌用冷生理鹽水漂洗去血液，濾紙吸干，用錫箔紙包裹，迅速置于液氮中，轉(zhuǎn)放于－70℃冰箱保存。

1.4 評價(jià)指標(biāo)

Ca2+采用比色法測試，比色儀器為721型分光光度計(jì)，試劑為南京建成生物研究所;線粒體Δψm采用JC－1脂質(zhì)熒光染料法檢測(線粒體膜電位檢測試劑盒，批號:KGA603，規(guī)格:50T)，儀器為流式細(xì)胞儀(美國BD公司，BD FACSCalibur)，試劑為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。指標(biāo)均由專人測試，嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性差異采用one－way ANOVA檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05，極顯著性水平為P＜0.01。

2 研究結(jié)果

2.1 8周抗阻訓(xùn)練對老齡大鼠腓腸肌胞漿Ca2+的影響

由表2可知，8周抗阻訓(xùn)練結(jié)束后，與安靜組相比，4個(gè)抗阻訓(xùn)練組大鼠腓腸肌Ca2+降低，其中30%和50%最大負(fù)重訓(xùn)練兩組有顯著性下降(P＜0.05);與無負(fù)重訓(xùn)練組比較，30%、50%、70%最大負(fù)重訓(xùn)練三組的差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這說明抗阻訓(xùn)練可以不同程度降低老齡大鼠腓腸肌Ca2+，并以中、低強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練的效果較好。

表2 安靜組與各抗阻訓(xùn)練組大鼠腓腸肌Ca2+比較

2.2 8周抗阻訓(xùn)練對老齡大鼠腓腸肌線粒體Δψm的影響

由表3可知，8周抗阻訓(xùn)練結(jié)束后，與安靜組相比，4個(gè)抗阻訓(xùn)練組大鼠腓腸肌線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)出現(xiàn)不同程度的減少，其中無負(fù)重、30%、50%最大負(fù)重訓(xùn)練三組有極顯著性減少(P＜0.01);與無負(fù)重訓(xùn)練組比較，30%最大負(fù)重訓(xùn)練組有顯著性減少(P＜0.05)，而50%和70%最大負(fù)重訓(xùn)練兩組無顯著性變化(P＞0.05)。這說明抗阻訓(xùn)練可以不同程度減少老齡大鼠腓腸肌線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，并以中、低強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練的效果較好。

表3 安靜組與各抗阻訓(xùn)練組大鼠線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)比較

圖1 大鼠抗組訓(xùn)練腓腸肌線粒體ΔΨmt流式細(xì)胞檢測

上圖1各圖右上象限為線粒體ΔΨmt正常的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，而右下象限為線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。右下象限細(xì)胞百分?jǐn)?shù)多，即線粒體膜電位下降的細(xì)胞數(shù)多，發(fā)生凋亡的細(xì)胞就增多。

3 分析與討論

細(xì)胞凋亡的重要信號通路是線粒體，在細(xì)胞凋亡發(fā)展過程中起著決定性作用，是細(xì)胞存亡的關(guān)鍵因素。細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化，如活性氧、紫外線、Ca2+等的變化可使線粒體內(nèi)外膜滲透性增加，ΔΨmt下降，促使促凋亡物質(zhì)的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］。ΔΨmt與其功能狀態(tài)密切相關(guān)，ΔΨmt下降是細(xì)胞凋亡的前兆［4］。ΔΨmt受MPTP的調(diào)控，MPTP是一種位于線粒體內(nèi)外膜之間的復(fù)合型通道，MPTP孔開放程度的改變直接影響ΔΨmt的變化，MPTP開放ΔΨmt下降，反之依然［5］。目前無法直接檢測MPTP開放程度，通過應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測ΔΨmt的變化，反映其開放程度［6］。JC－1是一種陽離子脂質(zhì)熒光染料作為檢測線粒體ΔΨmt指示劑，有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時(shí)以單體形式存在，高濃度時(shí)以多聚體形式存在，但均可在流式細(xì)胞儀綠色(FL－1)通道檢測出綠色熒光，正常健康線粒體的ΔΨmt具有極性，JC－1以多聚體存在線粒體內(nèi)且發(fā)射紅色熒光，被流式細(xì)胞儀紅色(FL－2)通道檢測到，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體ΔΨmt去極化，JC－1以單體形式存在與胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。本研究采用跑臺負(fù)重跑步方法作為抗阻訓(xùn)練研究其對老齡大鼠腓腸肌Ca2+及線粒體ΔΨmt的影響。結(jié)果顯示，不同負(fù)重抗組訓(xùn)練可以降低老齡大鼠腓腸肌Ca2+及線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分率。

衰老過程中肌肉體積和質(zhì)量逐漸下降，且隨著年齡的增長下降有增加的趨勢，導(dǎo)致肌肉萎縮。Song等［7］研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡對衰老骨骼肌纖維的萎縮有影響。胞凋亡的重要通路是線粒體，其通路受多種因素的干預(yù)，例如Ca2+。Ca2+在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起重要作用，細(xì)胞通過Ca2+濃度的變化調(diào)節(jié)生理功能［8］。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定能保持細(xì)胞的正常功能。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化時(shí)、線粒體主動攝取、釋放、調(diào)節(jié)胞漿Ca2+濃度，維持細(xì)胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)［9］。細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加可造成MPTP開放，從而引起Δψm下降甚至消失、造成細(xì)胞死亡［10］。細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+濃度過高，可刺激線粒體攝入Ca2+，導(dǎo)致線粒體內(nèi)出現(xiàn)鈣超載。Ca2+超載是引起 MPTP 開放［11］。He 等［12］發(fā)現(xiàn)，Ca2+能結(jié)合MPTP上的金屬結(jié)合位點(diǎn)，使MPTP開放，細(xì)胞色素c釋放，活化Caspase級鏈誘發(fā)細(xì)胞凋亡。上述研究表明:Ca2+變化與線粒體功能密切相關(guān)，是導(dǎo)致MPTP開放，ΔΨmt降低誘發(fā)細(xì)胞凋亡的原因之一。

有研究表明:大鼠游泳運(yùn)動后線粒體內(nèi)Ca2+濃度明顯增多，肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，證實(shí)運(yùn)動后骨骼肌線粒體內(nèi)Ca2+超載是肌細(xì)胞凋亡的誘因［13］。鄭師陵等研究也得出了相似的結(jié)論［14］。還有研究得出長時(shí)間力竭運(yùn)動或急性運(yùn)動后，線粒體內(nèi)Ca2+含量顯著增加［15，16］，其氧化磷酸化過程遭到破壞，能量代謝中斷，線粒體對胞漿Ca2+濃度的緩沖能力減弱，造成Ca2+紊亂。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:8周抗阻訓(xùn)練干預(yù)后，與衰老安靜組相比，各抗阻訓(xùn)練組大鼠腓腸肌Ca2+出現(xiàn)不同程度的降低，其中30%和50%最大負(fù)重訓(xùn)練兩組有顯著性下降(P＜0.05);與0%最大負(fù)重訓(xùn)練組比較，30%、50%、70%最大負(fù)重訓(xùn)練組間的差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明適宜負(fù)荷的抗阻訓(xùn)練能降低腓腸肌Ca2+含量。本實(shí)驗(yàn)對ΔΨmt測試結(jié)果也印證了這一結(jié)論。因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中各抗阻訓(xùn)練組大鼠ΔΨmt下降的細(xì)胞百分率也出現(xiàn)了不同程度的減少，與衰老安靜組相比，0%、30%、50%最大負(fù)重訓(xùn)練三組有極顯著性減少(P＜0.01);與0%最大負(fù)重訓(xùn)練組比較，30%最大負(fù)重訓(xùn)練組有顯著性減少(P＜0.05)，而50%和70%最大負(fù)重訓(xùn)練兩組間無顯著性變化(P＞0.05)。說明經(jīng)過8周抗阻訓(xùn)練能抑制老齡大鼠線粒體膜通透性升高和MPTP開放，從而抑制Δψm下降，維持線粒體的正常生理功能，且其效果與負(fù)荷強(qiáng)度有關(guān)。這提示:8周抗組訓(xùn)練能改善老齡大鼠骨骼肌代謝情況，降低腓腸肌胞漿Ca2+含量，相應(yīng)的改善線粒體功能，提高Δψm。但與之對應(yīng)的抗阻力訓(xùn)練組大鼠腓腸肌Ca2+顯著性下降(P＜0.05)，而線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分率有極顯著性減少(P＜0.01)，這也證實(shí)了Ca2+并非影響線粒體功能的唯一因素，比如活性氧、氧化應(yīng)激、Bcl－2家族等。鄭師陵等［17］通過大鼠游泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明運(yùn)動后第一周細(xì)胞凋亡的比例最高，而伴隨著ΔΨmt下降，第二周后顯著升高，第三周后逐漸下降，但仍高于對照組。劉麗萍等［18］研究表明:隨著游泳運(yùn)動時(shí)間的延長，肝細(xì)胞ΔΨmt的變化為升高、恢復(fù)、再升高。這表明隨著運(yùn)動時(shí)間的延長，線粒體逐漸適應(yīng)其運(yùn)動強(qiáng)度，并且提高其功能。本實(shí)驗(yàn)不足之處是沒有對老齡大鼠抗組訓(xùn)練第一周、第二周、第三周等后腓腸肌ΔΨmt的變化情況測試。程麗彩等［19］研究認(rèn)為8周運(yùn)動組肝細(xì)胞凋亡率顯著升高，線粒體ΔΨmt降低;12周運(yùn)動組肝細(xì)胞凋亡率升高，線粒體ΔΨmt升高。本實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果表明，8周抗阻訓(xùn)練后運(yùn)動組腓腸肌線粒體ΔΨmt升高的細(xì)胞百分率增加而不是降低，而12周的抗阻訓(xùn)練腓腸肌線粒體ΔΨmt升高的細(xì)胞百分率如何變化還不清楚，這與程麗彩等研究結(jié)果不同的原因可能是測試的組織和運(yùn)動方案不同所致。王長青等［20］研究認(rèn)為不同運(yùn)動負(fù)荷對線粒體ΔΨmt的影響各異，運(yùn)動引起線粒體ΔΨmt下降的同時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這提示運(yùn)動對線粒體ΔΨmt變化的影響還有待進(jìn)一步深入的研究。

4 結(jié)論

4.1 8周不同負(fù)重抗阻訓(xùn)練能不同程度降低老齡大鼠腓腸肌胞漿Ca2+含量，維持線粒體的正常生理功能，抑制MPTP開放。其中，低、中等負(fù)重抗阻訓(xùn)練效果較明顯。

4.2 8周不同負(fù)重抗阻訓(xùn)練能不同程度提高老齡大鼠腓腸肌線粒體Δψm，改善線粒體功能。其中，低、中等負(fù)重抗阻訓(xùn)練效果較好。

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