直腸癌組織中EB病毒的原位雜交檢測

，，，，

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院普外科,山東 青島 266003； 2 青島市婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科)

直腸癌組織中EB病毒的原位雜交檢測

閆海龍1，張建立1，胡順霞2，崔建1，孫振青1

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院普外科,山東 青島 266003； 2 青島市婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科)

目的探討EB病毒(EBV)感染與人直腸癌發(fā)生的關(guān)系。方法采用原位分子雜交技術(shù),對(duì)100例人直腸癌組織標(biāo)本中EBV編碼小分子RNA(EBER)進(jìn)行檢測。結(jié)果100例直腸癌標(biāo)本中癌細(xì)胞EBER均為陰性，有1例直腸癌組織間質(zhì)中浸潤的淋巴細(xì)胞EBER陽性。結(jié)論EBV感染與直腸癌的發(fā)生無明顯相關(guān)性。

直腸腫瘤；單純皰疹病毒屬；原位雜交

EB病毒(EBV)為γ-DNA皰疹病毒，在全世界普遍存在，該病毒首次發(fā)現(xiàn)于非洲Burkitt淋巴瘤培養(yǎng)細(xì)胞中，之后又在其他淋巴和上皮性腫瘤中證實(shí)了該病毒的存在[1-2]。95%的健康人攜帶EBV。國內(nèi)外的研究結(jié)果顯示，EBV與多種腫瘤如霍奇金病、低分化鼻咽癌以及周圍性淋巴瘤等的發(fā)生有密切關(guān)系[3]。EBV與腫瘤相關(guān)性的研究已逐漸引起人們的關(guān)注。目前，關(guān)于EBV與中國人胃腸道腫瘤關(guān)系的研究報(bào)道主要集中于EBV與胃癌的相關(guān)性方面[4-7]，而EBV與直腸癌發(fā)生的相關(guān)研究目前尚無明確的結(jié)論。本文采用原位分子雜交的方法對(duì)其進(jìn)行檢測，旨在研究EBV與中國人直腸癌發(fā)生的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本及其來源

直腸腫瘤組織標(biāo)本100例，取自2012年1—12月我院病理科保存的標(biāo)本。其中黏液腺癌6例，低分化腺癌5例，中分化腺癌89例。病人男61例，女39例；年齡37～88歲，平均(61±10)歲。

1.2標(biāo)本處理

標(biāo)本經(jīng)40 g/L甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)連續(xù)切片2張，厚度為5 μm。其中一張病理切片用于原位分子雜交實(shí)驗(yàn)；另一張行蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察，進(jìn)行組織病理學(xué)分類。

1.3EBV編碼小分子RNA(EBER)檢測

1.3.1探針合成及標(biāo)記 根據(jù)EBER1序列設(shè)計(jì)原徑雜交探針，其正義序列為5′-TCTGTGGCAGGA-GTGGTGGGCCCTGAACAT-3′，反義序列為5′-A-GACACCGTCCTCACCACCCGGGACTTGTA-3′，應(yīng)用Roche公司提供的Dig Oligonucleotide 3′-end Labeling Kit對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記。

1.3.2分子雜交 石蠟包埋切片用二甲苯溶液脫蠟，體積分?jǐn)?shù)1.00、0.90和0.70乙醇浸泡組織切片各5 min梯度水化，2×SSC洗片3 min共2次，200 g/L甲醛緩沖液固定20 min，2×SSC振蕩洗片3 min共3次。然后滴加胃蛋白酶(1 mg/L)，放置于37 ℃溫箱中，消化25～30 min，1 g/L甘氨酸溶液輕輕洗片約30 s，終止消化反應(yīng)。2×SSC清洗1次，加預(yù)雜交液(每張切片80 μL)，加地高辛標(biāo)記的EBER1寡核苷酸探針0.5 mg/L(終濃度)，蓋玻片覆蓋，于濕盒中37 ℃雜交反應(yīng)過夜。次日用2×SSC洗去蓋玻片，0.5×SSC洗片15 min共2次，去除雜交信號(hào)，應(yīng)用EBV相關(guān)胃癌組織切片作為陽性對(duì)照，EBV陰性胃癌組織切片(采用正義探針序列)作為特異性對(duì)照。

1.3.3信號(hào)檢測 用Blocking buffer封片40 min，加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37 ℃反應(yīng)1 h，使用Buffer1#振蕩洗片15 min共2次，Buffer3#振蕩洗片2 min，加入顯色液，置入濕盒中37 ℃反應(yīng)3 h，使用2×SSC洗片10～30 s，Buffer4#洗片3 min共3次，用5 g/L甲基綠復(fù)染15～20 min。待切片干燥后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，細(xì)胞核濃染且呈紫藍(lán)色者為EBER陽性信號(hào)。

2 結(jié) 果

本文100例直腸癌組織標(biāo)本中所有癌細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)EBER陽性信號(hào)(圖1A)。1例直腸癌組織間質(zhì)中的淋巴細(xì)胞呈EBER陽性反應(yīng)，陽性信號(hào)集中于淋巴細(xì)胞核內(nèi)，呈紫藍(lán)色(圖1B)。EBV相關(guān)胃癌組織中癌細(xì)胞均檢測到EBER陽性信號(hào)(圖1C)，EBV陰性胃癌組織中癌細(xì)胞均無EBER陽性信號(hào)(圖1D)。

A：直腸癌組織EBER陰性，背景為甲基綠染色，200倍；B：直腸癌組織間質(zhì)淋巴細(xì)胞EBER陽性反應(yīng)，紫藍(lán)色為陽性信號(hào)，200倍；C：EBER陽性胃癌組織，紫藍(lán)色為陽性信號(hào)，200倍；D：EBER陰性胃癌組織，背景為甲基綠染色，200倍。

圖1直腸癌組織EBV的原位雜交檢測

3 討 論

直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，病因目前仍不十分明確，其發(fā)病的相關(guān)因素有生活環(huán)境、遺傳、飲食等，直腸息肉也可作為獨(dú)立的發(fā)病因素，與直腸癌密切相關(guān)。近年來，EBV逐漸受到人們的關(guān)注，一方面是由于其對(duì)人類的普遍感染，同時(shí)它也是傳染性單核細(xì)胞增多癥的病因；更重要的是，越來越多的研究表明，EBV與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，國際癌癥研究署將EBV列為第一類致癌因子[8]。大量研究已經(jīng)證實(shí)，EBV與胃癌存在一定的相關(guān)性[4-6]。然而，EBV與直腸腫瘤相關(guān)性的研究，目前并無統(tǒng)一的結(jié)論，國內(nèi)外研究報(bào)道的結(jié)果也不盡相同，大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果顯示EBV與直腸腫瘤的發(fā)生沒有明顯的相關(guān)性[9]。

本文實(shí)驗(yàn)采用EBER1原位雜交技術(shù)，檢測100例直腸癌組織中EBV，未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，有1例癌組織間質(zhì)中散在的淋巴細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，由于淋巴細(xì)胞通常是EBV潛伏感染的場所，從而形成EBER陽性反應(yīng)。YUEN等[10]應(yīng)用EBER1原位分子雜交方法，檢測了36例結(jié)直腸腺癌中的EBV，未發(fā)現(xiàn)陽性病例，僅有腫瘤組織浸潤的少量淋巴細(xì)胞EBV陽性，提示EBV潛伏于這些淋巴細(xì)胞中。本文結(jié)果與其一致。CHO等[11]采用EBER1原位雜交方法檢測了274例結(jié)直腸癌、107例壺腹癌和142例食管癌EBV，結(jié)果顯示僅有腫瘤組織中浸潤的少量淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)EBV陽性，結(jié)直腸癌、壺腹癌和食管癌之間差異無顯著性，提示EBV與結(jié)直腸癌無明顯相關(guān)。KIJIMA等[12]采用同樣的方法檢測了313例胃癌、107例食管癌、102例結(jié)直腸癌、75例肺癌、61例乳癌、58例胰腺癌、45例甲狀腺癌EBV，結(jié)果顯示，有23例胃癌EBV陽性，占7.6%，與CHO等[1]結(jié)果一致。然而，KIM等[7]對(duì)CD21抗原在EBV相關(guān)腫瘤中的表達(dá)研究結(jié)果顯示，24例結(jié)直腸腺癌中有2例組織細(xì)胞呈EBER原位雜交陽性。KON等[13]對(duì)1例直腸淋巴上皮樣癌行免疫組化、PCR及原位雜交檢測，結(jié)果顯示EBV與直腸淋巴上皮樣癌之間關(guān)系密切。張建武等[14]采用PCR方法對(duì)112例結(jié)直腸腫瘤和非腫瘤的腸鏡活檢標(biāo)本進(jìn)行EBV DNA檢測，結(jié)果顯示EBV陽性率為2.9%，與CHO等[1]研究結(jié)果相符。雖然PCR檢測EBV具有較高的靈敏度，然而由于擴(kuò)增時(shí)無法保證只有腫瘤細(xì)胞DNA，相對(duì)于原位雜交來說，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，特異性較差，因此本文選擇了原位雜交方法，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

與其他EBV相關(guān)腫瘤，如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤等相比，EBV在直腸腫瘤組織中陽性率較低，說明EBV在直腸癌的發(fā)病過程中所起的作用可能有限。本文研究結(jié)果表明，100例直腸癌組織病理切片無EBV陽性者，結(jié)合以往研究結(jié)果，認(rèn)為直腸癌的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，EBV與直腸癌的發(fā)生無明顯相關(guān)性。

[1] CHIJIOKE O, AZZI T, NADAL D, et al. Innate immune responses against Epstein Barr virus infection[J]. J Leukoc Biol, 2013,94(6):1185-1190.

[2] 陳霞,馬文麗,梁爽,等. EB病毒活化對(duì)鼻咽癌基因表達(dá)模式的影響[J]. 癌癥, 2008,27(1):1-7.

[3] 高田賢蔵,林紫雯(譯),姚楨(校). EB病毒感染與致癌[J]. 日本醫(yī)學(xué)介紹, 2006,27(4):162-163.

[4] 胡順霞,王新穎,王云,等. EBV相關(guān)胃癌組織CTHRC1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013,49(3):189-191,195.

[5] 張青竹,王云,羅兵. EB病毒即刻早期BRLF1基因在淋巴瘤組織中多態(tài)性研究(英文)[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013(26):5030-5036.

[6] 張巖,賈玉平,王云,等. EBVaGC腫瘤差異表達(dá)的基因表達(dá)譜芯片篩選[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013,49(5):381-385.

[7] KIM Y S, PAIK S R, KIM H K, et al. Epstein-Barr virus and CD21 expression in gastrointestinal tumors[J]. Pathol Res Pract, 1998,194(10):705-711.

[8] 周小鴿. EB病毒小RNA檢測的臨床病理學(xué)意義[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2006,35(6):321-323.

[9] 劉換新,丁彥青,孫亞歐,等. 大腸腫瘤組織中EB病毒的原位雜交檢測[J]. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002,22(10):915-917.

[10] YUEN S T, CHUNG L P, LEUNG S Y, et al. In situ detection of Epstein-Barr virus in gastric and colorectal adenocarcinomas[J]. Am J Surg Pathol, 1994,18(11):1158-1163.

[11] CHO Y J, CHANG M S, PARK S H. In situ hybridization of Epstein-Barr virus tumor cells and tumor-infiltrating lymphocytes of the gastrointestinal tract[J]. Hum Pathol, 2001,32(3):297-301.

[12] KIJIMA Y, HOKITA S, TAKAO S, et al. Epstein-Barr virus involvement is mainly restricted to lymphoepithelial type of gastric carcinoma among various epithelial neoplasms[J]. J Med Virol, 2001,64(4):513-518.

[13] KON S, KASAI K, TSUZUKI N, et al. Lymphoepithelioma-like carcinoma of rectum: possible relation with EBV[J]. Pathol Res Pract, 2001, 197(8):577-582.

[14] 張建武,王衛(wèi)萍,于成功,等. EB病毒感染與結(jié)直腸癌的相關(guān)性[J]. 海南醫(yī)學(xué), 2009,20(11):1-3.

(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

DETECTIONOFINSITUHYBRIDIZATIONOFEPSTEIN-BARRVIRUSINRECTALCANCER

YANHailong,ZHANGJianli,HUShunxia,CUIJian,SUNZhenqing

(Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between epstein-barr virus (EBV) and rectal cancer.MethodsApplying in situ molecular hybridization technique, the small-molecule RNA fragments of EBV in samples of 100 patients with rectal cancer were detected.ResultsEBV was not found in the cancer specimens. One of the cases was found infiltrative lymphocytes in interstitial tissue.ConclusionEBV infection is not associated with the occurrence of rectal cancer.

rectal neoplasms; simplexvirus; in situ hybridization

2013-08-31;

2014-04-25

閆海龍(1986-)，男，碩士研究生。

張建立(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。

R735.37

A

1008-0341(2014)03-0202-03