瑞香狼毒對(duì)健康人體外外周血淋巴細(xì)胞微核率的影響

張三潤(rùn)等

[摘要] 目的 初步探討瑞香狼毒對(duì)健康年輕人體外外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)染色體畸變的影響效應(yīng)。 方法 在外周血培養(yǎng)過(guò)程中加入不同劑量的瑞香狼毒水煎液，顯微鏡下檢測(cè)微核率的變化，通過(guò)x2檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 瑞香狼毒終濃度為2.5、5、10mg/mL實(shí)驗(yàn)組的微核出現(xiàn)率分別是1.63‰、5.13‰和7.25‰，對(duì)照組微核率為1.50‰，第1個(gè)低劑量實(shí)驗(yàn)組微核率與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。后兩個(gè)中劑量和高劑量實(shí)驗(yàn)組微核率顯著高于對(duì)照組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。 結(jié)論 超過(guò)一定劑量的瑞香狼毒水煎液可能對(duì)健康人體外外周血淋巴細(xì)胞遺傳物質(zhì)有不同程度的毒性作用。

[關(guān)鍵詞] 瑞香狼毒；淋巴細(xì)胞；微核

[中圖分類(lèi)號(hào)] Q464 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）16-40-03

Effects of Stellera chamaejasme L. on the health of human lymphocyte micronucleus rate of peripheral blood

ZHANG Sanrun ZHOU Haole ZHENG Mingxia BUREN Qiqige WANG Jinfeng ZHANG Dongze HAO Xingxia

Department of Genetics， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010059， China

[Abstract] Objective To discuss toxicity effect of Stellera chamaejasme L.on lymphocyte chromosome in healthy young human peripheral blood. Methods Stellera chamaejasme L.water decoction with different doses was added to the peripheral blood lymphocyte culture fluid， then micronucleus rates were detected under the microscope. The significance tests were conducted by x2 test method. Results The micronucleus rates of the experimental groups in stellera chamaejasme L. exposure concentration of 2.5， 5， 10mg/ml were 1.63‰， 5.13‰ and 7.25‰. The micronucleus rate of control group was 1.50‰. The micronucleus rate of the first low dose experimental group compared with the control group no significant difference（P>0.05）. The micronucleus rates of middle and high doses of the experimental groups were significantly higher than that of control group （P<0.01）. Conclusion Stellera chamaejasme L. of above a certain dose may exert different degree of damage to genetic material on the health of human peripheral blood lymphocytes.

[Key words] Stellera chamaejasme L.； Lymphocyte； Micronucleus

瑞香狼毒屬于瑞香科，是多年生草本植物，具有軟堅(jiān)散結(jié)、去痛、止咳祛痰、抗菌和抗病毒等多種藥效，可作為一種理想的天然藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，狼毒提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制活性，例如，肺癌、食管癌、肝癌等惡性腫瘤的治療，已廣泛應(yīng)用于我國(guó)民間[1]，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者也報(bào)道，瑞香狼毒的各種提取物或分離出來(lái)的某種單一成分均具有顯著的抗腫瘤作用，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞周期等機(jī)制而起到抗腫瘤功效[2-8]。但關(guān)于瑞香狼毒在治療疾病過(guò)程中，對(duì)人體是否有毒副作用方面的報(bào)道較少，本文就瑞香狼毒對(duì)人外體外周血淋巴細(xì)胞染色體毒性進(jìn)行了初步研究，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

觀察微核所用的BK5000生物顯微鏡由重慶奧

特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；1640混合培養(yǎng)基由北京易世盛達(dá)科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 血樣

外周血由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)8位健康大學(xué)生提供，男4例，女4例，平均年齡21歲。他們均具有良好的生活習(xí)慣，不抽煙不喝酒，沒(méi)有接觸過(guò)能引起染色體畸變的誘變劑以及其他不良環(huán)境因素，均無(wú)染色體病家族史。

1.3 藥品

瑞香狼毒購(gòu)自包頭市醫(yī)藥有限責(zé)任公司，取瑞香狼毒生藥片10g，加蒸餾水100mL，煮沸后文火煎15min，濾去藥渣后，加蒸餾水至100mL，高壓滅菌后作為原液放入冰箱中備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

上述每位大學(xué)生被抽取的外周血分為兩份，一份用于染毒實(shí)驗(yàn)組，另一份用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)組。染毒

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01endprint

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)3瓶，每瓶培養(yǎng)液在加入外周血的同時(shí)分別加入不同濃度的瑞香狼毒水煎液0.5mL，使3瓶培養(yǎng)液中瑞香狼毒的終濃度分別為2.5、5、10mg/mL。對(duì)照實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)1瓶，培養(yǎng)時(shí)在加入外周血的同時(shí)加入0.5mL生理鹽水。

1.5 微核觀察和數(shù)據(jù)分析

微核標(biāo)本的制備與檢測(cè)方法參考Chang等[9]的方法進(jìn)行。每瓶培養(yǎng)液制作的微核標(biāo)本在顯微鏡下觀察1000個(gè)胞漿完整的淋巴細(xì)胞。在這1000個(gè)細(xì)胞中，如果看到與細(xì)胞核顏色一樣，并且位于細(xì)胞核附近游離的圓形或橢圓形小核（小于細(xì)胞核1/3）的細(xì)胞計(jì)為1個(gè)微核細(xì)胞，用千分率（‰）表示微核率。微核觀察數(shù)據(jù)用x2檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

3 討論

微核是由染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)畸變導(dǎo)致的。在有絲分裂過(guò)程中，如果細(xì)胞受到某些環(huán)境因子的刺激會(huì)引起染色體發(fā)生斷裂，形成無(wú)著絲粒的短片，或?qū)е录忓N絲斷裂，使整條染色體失去紡錘絲的牽引作用，上述無(wú)著絲粒的短片或失去紡錘絲的整條染色體，在分裂末期不能參與子細(xì)胞核的形成，而形成了位于子核之外的核塊。當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，這些核塊便濃縮成主核之外的獨(dú)立小核，即微核。所以，在間期細(xì)胞中的微核是染色體畸變的結(jié)果，它是染色體畸變后所表現(xiàn)出來(lái)的一種形式，它在細(xì)胞中的出現(xiàn)頻率一般與染色體畸變率呈正相關(guān)[10]。大量研究結(jié)果表明，隨著環(huán)境中誘變劑劑量的增加或輻射的不斷累積微核的出現(xiàn)率會(huì)隨之增高。所以，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者以微核率為指標(biāo)來(lái)檢測(cè)染色體畸變程度。例如，一些食品添加劑、某些化學(xué)試劑、某些新藥以及其他環(huán)境因素是否具有遺傳毒性效應(yīng)均可利用檢測(cè)微核率的簡(jiǎn)易手段進(jìn)行有效的評(píng)價(jià)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用不同的研究方法，以不同的指標(biāo)檢測(cè)了狼毒的毒性作用。劉萍等[11]報(bào)道狼毒大載水提物在較高劑量下對(duì)小鼠有致突變作用，但在低劑量下無(wú)明顯毒性。楊珺等[12]研究表明：用瑞香狼毒提取液干預(yù)，結(jié)果對(duì)大鼠原代培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞的增殖有比較明顯的抑制效應(yīng)，并且隨著瑞香狼毒提取液劑量的增加而這種抑制效應(yīng)也隨著加強(qiáng)。同時(shí)當(dāng)瑞香狼毒提取液超過(guò)一定劑量時(shí)表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中瑞香狼毒終濃度為2.5mg/mL時(shí)未檢測(cè)到微核率的顯著變化，說(shuō)明低劑量的瑞香狼毒可能不會(huì)引起遺傳損傷；而中劑量（5mg/mL）和高劑量（10mg/mL）的瑞香狼毒可使健康人體外淋巴細(xì)胞微核率明顯增高，說(shuō)明超過(guò)一定劑量的瑞香狼毒水煎液可能對(duì)人體染色體有致?lián)p傷作用，其損傷機(jī)理是引起染色體斷裂還是染色體不分離還有待于進(jìn)一步研究。我們知道，染色體即使是微小片段的改變也會(huì)累及到很多基因，與致癌、致畸以及其他疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。所以，狼毒雖然有抗腫瘤等治療多種疾病的功效，但不能忽視對(duì)人體可能具有的潛在的遺傳毒性作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 潘國(guó)鳳，楊慶，翁小剛，等.瑞香狼毒抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（12）：873.

[2] 王敏，賈正平，馬駿，等.瑞香狼毒總黃酮提取物的抗腫瘤作用[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（8）：603.

[3] 邢立強(qiáng)，李旺，孫黎，等.瑞香狼毒提取物逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥的免疫組化研究[J].陜西中醫(yī)，2007，28（4）：500.

[4] 楊柯，張京玲，黃謙，等.狼毒水提液對(duì)人A549肺癌細(xì)胞凋亡的影響[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2011，11（5）：88.

[5] 劉曉霓，李玉潔，楊慶，等.瑞香狼毒醇提物體外抗腫瘤作用研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（22）：3048-3051.

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[6] 李鴻君，邢立強(qiáng)，李旺，等.瑞香狼毒水提取物對(duì)肺腺癌細(xì)胞株耐藥及凋亡的影響[J].河北醫(yī)藥，2013，35（6）：823-825.

[7] 潘國(guó)鳳，楊慶，劉安，等.瑞香狼毒藥效組分抑制小鼠皮下移植瘤H22的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（4）：438-442.

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[9] Chang WP，Tsai MS，Hwang JS，et al. Follow-up in the micronucleus frequencies and its subsets in human population with chronic lowdose gamma-irradiation exposure[J].Mutat Res，1999，428（1-2）：99-105.

[10] 楊茜，杜金茹，栗淑媛，等.錳中毒患者外周血淋巴細(xì)胞微核率的觀察[J].化工勞動(dòng)保護(hù)（工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病分冊(cè)），1995，16（3）：110-111.

[11] 劉萍，杜娟，于麗華，等.大戟水提物對(duì)小鼠致突變作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，38（1）：27，31.

[12] 楊珺，王世嶺，吳坤，等.瑞香狼毒提取液對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的抑制與其細(xì)胞毒性作用[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9（31）：139-141.

（收稿日期：2014-03-24）endprint

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)3瓶，每瓶培養(yǎng)液在加入外周血的同時(shí)分別加入不同濃度的瑞香狼毒水煎液0.5mL，使3瓶培養(yǎng)液中瑞香狼毒的終濃度分別為2.5、5、10mg/mL。對(duì)照實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)1瓶，培養(yǎng)時(shí)在加入外周血的同時(shí)加入0.5mL生理鹽水。

1.5 微核觀察和數(shù)據(jù)分析

微核標(biāo)本的制備與檢測(cè)方法參考Chang等[9]的方法進(jìn)行。每瓶培養(yǎng)液制作的微核標(biāo)本在顯微鏡下觀察1000個(gè)胞漿完整的淋巴細(xì)胞。在這1000個(gè)細(xì)胞中，如果看到與細(xì)胞核顏色一樣，并且位于細(xì)胞核附近游離的圓形或橢圓形小核（小于細(xì)胞核1/3）的細(xì)胞計(jì)為1個(gè)微核細(xì)胞，用千分率（‰）表示微核率。微核觀察數(shù)據(jù)用x2檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

3 討論

微核是由染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)畸變導(dǎo)致的。在有絲分裂過(guò)程中，如果細(xì)胞受到某些環(huán)境因子的刺激會(huì)引起染色體發(fā)生斷裂，形成無(wú)著絲粒的短片，或?qū)е录忓N絲斷裂，使整條染色體失去紡錘絲的牽引作用，上述無(wú)著絲粒的短片或失去紡錘絲的整條染色體，在分裂末期不能參與子細(xì)胞核的形成，而形成了位于子核之外的核塊。當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，這些核塊便濃縮成主核之外的獨(dú)立小核，即微核。所以，在間期細(xì)胞中的微核是染色體畸變的結(jié)果，它是染色體畸變后所表現(xiàn)出來(lái)的一種形式，它在細(xì)胞中的出現(xiàn)頻率一般與染色體畸變率呈正相關(guān)[10]。大量研究結(jié)果表明，隨著環(huán)境中誘變劑劑量的增加或輻射的不斷累積微核的出現(xiàn)率會(huì)隨之增高。所以，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者以微核率為指標(biāo)來(lái)檢測(cè)染色體畸變程度。例如，一些食品添加劑、某些化學(xué)試劑、某些新藥以及其他環(huán)境因素是否具有遺傳毒性效應(yīng)均可利用檢測(cè)微核率的簡(jiǎn)易手段進(jìn)行有效的評(píng)價(jià)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用不同的研究方法，以不同的指標(biāo)檢測(cè)了狼毒的毒性作用。劉萍等[11]報(bào)道狼毒大載水提物在較高劑量下對(duì)小鼠有致突變作用，但在低劑量下無(wú)明顯毒性。楊珺等[12]研究表明：用瑞香狼毒提取液干預(yù)，結(jié)果對(duì)大鼠原代培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞的增殖有比較明顯的抑制效應(yīng)，并且隨著瑞香狼毒提取液劑量的增加而這種抑制效應(yīng)也隨著加強(qiáng)。同時(shí)當(dāng)瑞香狼毒提取液超過(guò)一定劑量時(shí)表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中瑞香狼毒終濃度為2.5mg/mL時(shí)未檢測(cè)到微核率的顯著變化，說(shuō)明低劑量的瑞香狼毒可能不會(huì)引起遺傳損傷；而中劑量（5mg/mL）和高劑量（10mg/mL）的瑞香狼毒可使健康人體外淋巴細(xì)胞微核率明顯增高，說(shuō)明超過(guò)一定劑量的瑞香狼毒水煎液可能對(duì)人體染色體有致?lián)p傷作用，其損傷機(jī)理是引起染色體斷裂還是染色體不分離還有待于進(jìn)一步研究。我們知道，染色體即使是微小片段的改變也會(huì)累及到很多基因，與致癌、致畸以及其他疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。所以，狼毒雖然有抗腫瘤等治療多種疾病的功效，但不能忽視對(duì)人體可能具有的潛在的遺傳毒性作用。

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[5] 劉曉霓，李玉潔，楊慶，等.瑞香狼毒醇提物體外抗腫瘤作用研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（22）：3048-3051.

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[6] 李鴻君，邢立強(qiáng)，李旺，等.瑞香狼毒水提取物對(duì)肺腺癌細(xì)胞株耐藥及凋亡的影響[J].河北醫(yī)藥，2013，35（6）：823-825.

[7] 潘國(guó)鳳，楊慶，劉安，等.瑞香狼毒藥效組分抑制小鼠皮下移植瘤H22的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（4）：438-442.

[8] 王義善，鄭秋生，賈喜鳳，等.狼毒抑制降低癌細(xì)胞惡性表型小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移及彗星電泳實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)雜志，2006，47（增刊）：148-149.

[9] Chang WP，Tsai MS，Hwang JS，et al. Follow-up in the micronucleus frequencies and its subsets in human population with chronic lowdose gamma-irradiation exposure[J].Mutat Res，1999，428（1-2）：99-105.

[10] 楊茜，杜金茹，栗淑媛，等.錳中毒患者外周血淋巴細(xì)胞微核率的觀察[J].化工勞動(dòng)保護(hù)（工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病分冊(cè)），1995，16（3）：110-111.

[11] 劉萍，杜娟，于麗華，等.大戟水提物對(duì)小鼠致突變作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，38（1）：27，31.

[12] 楊珺，王世嶺，吳坤，等.瑞香狼毒提取液對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的抑制與其細(xì)胞毒性作用[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9（31）：139-141.

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實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)3瓶，每瓶培養(yǎng)液在加入外周血的同時(shí)分別加入不同濃度的瑞香狼毒水煎液0.5mL，使3瓶培養(yǎng)液中瑞香狼毒的終濃度分別為2.5、5、10mg/mL。對(duì)照實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)1瓶，培養(yǎng)時(shí)在加入外周血的同時(shí)加入0.5mL生理鹽水。

1.5 微核觀察和數(shù)據(jù)分析

微核標(biāo)本的制備與檢測(cè)方法參考Chang等[9]的方法進(jìn)行。每瓶培養(yǎng)液制作的微核標(biāo)本在顯微鏡下觀察1000個(gè)胞漿完整的淋巴細(xì)胞。在這1000個(gè)細(xì)胞中，如果看到與細(xì)胞核顏色一樣，并且位于細(xì)胞核附近游離的圓形或橢圓形小核（小于細(xì)胞核1/3）的細(xì)胞計(jì)為1個(gè)微核細(xì)胞，用千分率（‰）表示微核率。微核觀察數(shù)據(jù)用x2檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

3 討論

微核是由染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)畸變導(dǎo)致的。在有絲分裂過(guò)程中，如果細(xì)胞受到某些環(huán)境因子的刺激會(huì)引起染色體發(fā)生斷裂，形成無(wú)著絲粒的短片，或?qū)е录忓N絲斷裂，使整條染色體失去紡錘絲的牽引作用，上述無(wú)著絲粒的短片或失去紡錘絲的整條染色體，在分裂末期不能參與子細(xì)胞核的形成，而形成了位于子核之外的核塊。當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，這些核塊便濃縮成主核之外的獨(dú)立小核，即微核。所以，在間期細(xì)胞中的微核是染色體畸變的結(jié)果，它是染色體畸變后所表現(xiàn)出來(lái)的一種形式，它在細(xì)胞中的出現(xiàn)頻率一般與染色體畸變率呈正相關(guān)[10]。大量研究結(jié)果表明，隨著環(huán)境中誘變劑劑量的增加或輻射的不斷累積微核的出現(xiàn)率會(huì)隨之增高。所以，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者以微核率為指標(biāo)來(lái)檢測(cè)染色體畸變程度。例如，一些食品添加劑、某些化學(xué)試劑、某些新藥以及其他環(huán)境因素是否具有遺傳毒性效應(yīng)均可利用檢測(cè)微核率的簡(jiǎn)易手段進(jìn)行有效的評(píng)價(jià)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用不同的研究方法，以不同的指標(biāo)檢測(cè)了狼毒的毒性作用。劉萍等[11]報(bào)道狼毒大載水提物在較高劑量下對(duì)小鼠有致突變作用，但在低劑量下無(wú)明顯毒性。楊珺等[12]研究表明：用瑞香狼毒提取液干預(yù)，結(jié)果對(duì)大鼠原代培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞的增殖有比較明顯的抑制效應(yīng)，并且隨著瑞香狼毒提取液劑量的增加而這種抑制效應(yīng)也隨著加強(qiáng)。同時(shí)當(dāng)瑞香狼毒提取液超過(guò)一定劑量時(shí)表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中瑞香狼毒終濃度為2.5mg/mL時(shí)未檢測(cè)到微核率的顯著變化，說(shuō)明低劑量的瑞香狼毒可能不會(huì)引起遺傳損傷；而中劑量（5mg/mL）和高劑量（10mg/mL）的瑞香狼毒可使健康人體外淋巴細(xì)胞微核率明顯增高，說(shuō)明超過(guò)一定劑量的瑞香狼毒水煎液可能對(duì)人體染色體有致?lián)p傷作用，其損傷機(jī)理是引起染色體斷裂還是染色體不分離還有待于進(jìn)一步研究。我們知道，染色體即使是微小片段的改變也會(huì)累及到很多基因，與致癌、致畸以及其他疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。所以，狼毒雖然有抗腫瘤等治療多種疾病的功效，但不能忽視對(duì)人體可能具有的潛在的遺傳毒性作用。

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（收稿日期：2014-03-24）endprint