深層海水對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用＊

李為明，崔 進(jìn)△，徐鵬遠(yuǎn)，代佑果

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院干療外科，昆明650101；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院普外科，昆明650118）

創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜而有序的過(guò)程，不僅涉及細(xì)胞自身的運(yùn)動(dòng)、黏附、通訊和分化等，也包含細(xì)胞內(nèi)、外物質(zhì)代謝和基因的啟動(dòng)、調(diào)控等一系列生化和分子生物學(xué)反應(yīng)，影響上述過(guò)程的因素繁多，目前公認(rèn)的兩個(gè)重要因素是感染程度和營(yíng)養(yǎng)狀況。微量元素作為維持機(jī)體生命活動(dòng)和組織細(xì)胞新陳代謝的重要物質(zhì)，與其他營(yíng)養(yǎng)成分一樣，直接或間接參與到創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的細(xì)胞免疫、傷口愈合及抗氧化反應(yīng)等多個(gè)環(huán)節(jié)，過(guò)多或不足都會(huì)影響創(chuàng)面的愈合［1］。深層海水是海平面200m以下的海水，其水質(zhì)穩(wěn)定而潔凈，富含人體細(xì)胞所需礦物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分，病原菌也極少。本研究旨在利用深層海水富含平衡易吸收微量元素的特點(diǎn)，探討其是否能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合，為創(chuàng)面修復(fù)提供新的方法，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)深層海水在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 深層海水的提取、處理及主要元素含量 在我國(guó)南海海域獲取海平面200m以下的深層海水，避光運(yùn)至昆明，室溫避光儲(chǔ)存，經(jīng)超微過(guò)濾后，用銅鋅合金（KDF）除去海水中的重金屬，反復(fù)凍融方法濃縮并去除海水中多余的鹽分濃縮海水，制備成生理性深層海水（physiological deep sea water，PDSW）常規(guī)檢測(cè)主要元素的含量（表1），再稀釋成45、90mg／mL的深層海水，供后述實(shí)驗(yàn)用。深層海水的硬度以如下公式計(jì)算［2］：硬度＝Mg（mg／L）×4.1＋Ca（mg／L）×2.5。

表1 PDSW中主要元素成分含量＊（mg／L）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 昆明種雄性小鼠24只購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，4周齡，體質(zhì)量（18.0±2.0）g，選取同一窩次兄弟配對(duì)，避免遺傳基因差別，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。混合飼料單籠飼養(yǎng)，分為A組（深層海水）和B組（自來(lái)水），每組12只，實(shí)驗(yàn)前兩組分別以深層海水和自來(lái)水給小鼠自由飲用14d，計(jì)算兩組小鼠每日飲水、飲食量，術(shù)前1d背部脫毛。

1.3 方法

1.3.1 小鼠創(chuàng)傷模型建立 以戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔注射麻醉，在小鼠背部以1.0cm×1.0cm方格預(yù)定創(chuàng)傷面積，用眼科剪沿預(yù)定線修剪皮膚至肌肉筋膜表面，徹底止血、消毒，形成大小為1.0cm×1.0cm的創(chuàng)面。創(chuàng)面形成后A組以深層海水，B組以自來(lái)水自由飲用，混合飼料單籠飼養(yǎng)。

1.3.2 創(chuàng)面形態(tài)及愈合的觀察 創(chuàng)傷手術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始，每隔1天檢測(cè)1次創(chuàng)傷恢復(fù)情況，直到創(chuàng)傷完全愈合為止。檢測(cè)方法是用透明方格紙描繪創(chuàng)口，掃描入電腦后以專用軟件Adobe Photoshop CS2測(cè)量創(chuàng)口面積，并根據(jù)創(chuàng)口面積變化來(lái)計(jì)算創(chuàng)口的愈合程度。計(jì)算公式：創(chuàng)面愈合率＝（創(chuàng)面面積－各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面面積）÷創(chuàng)面面積×100%。

1.3.3 標(biāo)本取材及處理 術(shù)后第3、5、7天分別取創(chuàng)緣組織，固定于4%多聚甲醛中，常規(guī)石蠟包埋切片，行常規(guī)HE染色，100倍光鏡下觀察染色切片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Adobe Photoshop CS2及SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠飲水、飲食量比較 在相同的飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng)14d，兩組小鼠飲食、飲水量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 小鼠14d飲食、飲水量（n＝12，x±s）

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 （1）A組：創(chuàng)傷后第3天，創(chuàng)面基底部可見(jiàn)較薄一層鮮紅色的肉芽組織，觸之易出血，創(chuàng)緣未見(jiàn)上皮生長(zhǎng)，部分創(chuàng)面仍有少許淡黃色滲出，創(chuàng)面縮小不明顯；創(chuàng)傷后第5天，創(chuàng)面被肉芽組織填充，表面呈顆粒狀，肉芽組織較堅(jiān)實(shí)，創(chuàng)面較前明顯縮小，表面有痂皮覆蓋（圖1），可見(jiàn)白色新生上皮由四周向創(chuàng)面中心生長(zhǎng)，創(chuàng)面基本無(wú)滲出物；創(chuàng)傷后第7天，創(chuàng)面迅速縮小，大部分痂皮剝落，表面由新生上皮覆蓋；創(chuàng)傷后第10天，大部分創(chuàng)面完全愈合，張力稍大于周圍皮膚。（2）B組：創(chuàng)傷后第3天，創(chuàng)面水腫，炎性滲液多，創(chuàng)面基底部有少量不完整的肉芽組織，顏色淡紅，創(chuàng)緣無(wú)上皮生長(zhǎng)，創(chuàng)面未見(jiàn)縮??；創(chuàng)傷后第5天，創(chuàng)面水腫減輕明顯，滲出減少，由肉芽組織填充，創(chuàng)面較前縮小，表面有痂皮覆蓋，部分小鼠創(chuàng)面有少量新生上皮由四周向創(chuàng)面中心生長(zhǎng)（圖2）；創(chuàng)傷后第7天，創(chuàng)面縮小較前明顯，大部分創(chuàng)面仍有痂皮覆蓋，小部分創(chuàng)面痂皮下按壓有少許分泌物，痂皮周圍創(chuàng)面由新生上皮覆蓋；創(chuàng)傷后第12～13 d，創(chuàng)面完全愈合，張力大于周圍皮膚明顯。

2.2 創(chuàng)面愈合率 創(chuàng)面形成后第3天開(kāi)始，A組小鼠的創(chuàng)面愈合率35.3%±1.3%高于B組34.4%±1.7%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；創(chuàng)面形成后第5天開(kāi)始，A組小鼠的創(chuàng)面愈合率55.1%±1.8%明顯高于B組51.8%±1.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；創(chuàng)面形成后第7天，A組小鼠創(chuàng)面愈合率達(dá)87.1%±1.6%，B組愈合率為A組78.2%±2.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖1 A組第5天

圖2 B組第5天

圖3

2.3 光鏡觀察 （1）A組：創(chuàng)傷后第3天新生的肉芽組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，新生毛細(xì)血管生成，伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增生明顯，核呈圓形或橢圓形，染色較深；創(chuàng)傷后第5天，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，成纖維細(xì)胞數(shù)量多，染色較深，毛細(xì)血管成分多（圖4）；創(chuàng)傷后第7天，新生毛細(xì)血管及炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，成熟的成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞排列成束狀，較為整齊，紅染的基質(zhì)成分均勻（圖5）。（2）B組：創(chuàng)傷后3d炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞數(shù)量較其他組少，排列紊亂；創(chuàng)傷后5d，肉芽組織中有少量毛細(xì)血管形成，細(xì)胞以炎癥細(xì)胞為主，成纖維細(xì)胞雖較前增多，但比A組少，毛細(xì)血管少見(jiàn)（圖6）；創(chuàng)傷后7d，炎癥細(xì)胞逐漸減少，成纖維細(xì)胞明顯增多，排列呈漩渦狀，較為紊亂，見(jiàn)圖7。

圖4 A組第5天（HE×100）；

圖5 A組第7天（HE×100）；

圖6 B組第5天（HE×100）；

圖7 B組第7天（HE×100）

3 討 論

深層海水一般是指海平面200m以下的海水，水質(zhì)穩(wěn)定而潔凈、富含人體細(xì)胞所需、成分比例組合與人體體液相似、人體極易吸收的礦物質(zhì)成分，病原菌也極少。1996年日本學(xué)者Yoshiyuki［3］檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，深層海水含有82種元素，同時(shí)測(cè)出了各元素的含量。當(dāng)前，深層海水已經(jīng)應(yīng)用在食品、農(nóng)業(yè)、化妝品、醫(yī)學(xué)等各領(lǐng)域，也有利用深層海水改善微量元素失衡來(lái)治療特應(yīng)性皮炎的報(bào)道［4］，而深層海水應(yīng)用于創(chuàng)面的修復(fù)，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。

微量元素作為人體內(nèi)重要代謝介質(zhì)，參與人體數(shù)量眾多的酶類和激素的合成與活化，除對(duì)機(jī)體的代謝、免疫、細(xì)胞分裂增殖等具有調(diào)控作用外，還可影響體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，并參與細(xì)胞外基質(zhì)合成與分解、成纖維細(xì)胞的形成與增生及細(xì)胞因子的生成與釋放，其含量的變化一定程度上影響著機(jī)體的新陳代謝和創(chuàng)面的愈合。近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重?zé)齻笱?、尿液和局部組織中微量元素的含量均發(fā)生一些異常變化，這些變化可能對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)過(guò)程帶來(lái)許多不利影響，并認(rèn)為諸多微量元素的變化，可能與創(chuàng)面修復(fù)期需求量增加、持續(xù)丟失與攝入不足等因素有關(guān)，及時(shí)補(bǔ)充微量元素，有利于恢復(fù)其正常濃度，促進(jìn)創(chuàng)面愈合［5－8］。

創(chuàng)傷后血液和創(chuàng)面局部組織均可發(fā)生微量元素的異常，這一觀點(diǎn)在醫(yī)學(xué)界已基本得到認(rèn)可。現(xiàn)市場(chǎng)出現(xiàn)各種補(bǔ)充微量元素的人工合成品（如：微量元素片），含量只有幾種或幾十種元素，人體內(nèi)所有的微量元素都存在有直接或間接的關(guān)系，彼此相互影響，其相互作用錯(cuò)綜復(fù)雜，因此，補(bǔ)充部分微量元素必然達(dá)不到預(yù)期效果，有時(shí)反而適得其反。深層海水含有人體所需、易吸收、平衡的所有元素，通過(guò)口服深層海水可以達(dá)到改善機(jī)體微量元素平衡。本研究中，首先給予小鼠口服深層海水14d，恢復(fù)機(jī)體的微量元素平衡后，在15d建立創(chuàng)傷創(chuàng)面模型，繼續(xù)給予口服深層海水，改善因創(chuàng)傷導(dǎo)致的微量元素失衡，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目的就是要充分利用深層海水來(lái)調(diào)節(jié)小鼠機(jī)體微量元素平衡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在創(chuàng)傷后第3天就出現(xiàn)深層海水的促創(chuàng)傷愈合的優(yōu)勢(shì)，但此時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），考慮原因?yàn)槲⒘吭厥侵鸩秸{(diào)整的過(guò)程。在5d以后，深層海水組的創(chuàng)面愈合率較自來(lái)水組有明顯提高。行組織學(xué)觀察同時(shí)也發(fā)現(xiàn)深層海水組成熟的成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞排列成束狀，較為整齊。

綜上所述，深層海水可以促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，深層海水發(fā)揮作用的原因目前考慮為其豐富、易吸收、平衡的微量元素，下一步本研究將設(shè)計(jì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組創(chuàng)傷前后血液和局部微量元素的變化，以驗(yàn)證其理論。

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