不同種源太子參中多糖和氨基酸含量的比較研究△

楊昌貴，江維克*，周 濤，肖承鴻，艾強，張代金

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州三元太寶實業(yè)有限公司，貴州 施秉 556200)

不同種源太子參中多糖和氨基酸含量的比較研究△

楊昌貴1，江維克1*，周 濤1，肖承鴻1，艾強1，張代金2

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州三元太寶實業(yè)有限公司，貴州 施秉 556200)

目的：通過對9個太子參種源的多糖和17種氨基酸含量進行測定，考察同一種源在不同環(huán)境和不同管理模式下多糖和氨基酸含量變化，研究影響太子參質(zhì)量的主要因素。方法：采用顯色比色法測定多糖含量，采用柱前衍生化-HPLC法測定17種氨基酸含量。結(jié)果：太子參9個種源間藥材的多糖含量差異比較大，其中貴州施秉逸生種源和安徽種源的多糖含量超過50%。太子參9個種源間藥材的總氨基酸和人體必需氨基酸含量差異不大，不同的氨基酸在不同種源中的含量差異卻較大，其中精氨酸和天門冬氨酸在不同種源藥材中的含量均較高，9個種源藥材中的平均含量分別為2.49%和1.41%。結(jié)論：多糖含量可以作為太子參種源篩選、栽培環(huán)境和管理方式考察的指標(biāo)；太子參中氨基酸含量主要與繁殖方式有關(guān)。

太子參；種源；多糖含量；氨基酸含量

太子參為石竹科Caryophyllaceae植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺之功效[1]。現(xiàn)代化學(xué)與藥理研究表明，太子參中含有三萜皂苷、多糖等化學(xué)成分，具有改善慢性心衰、改善記憶、降糖、抗氧化等藥理作用[2-6]。

自20世紀(jì)90年代初貴州施秉縣從福建柘榮縣成功引種了太子參后，在施秉及其周邊地區(qū)逐漸形成了規(guī)模種植，隨著太子參保健食品的開發(fā)利用，貴州太子參的種植規(guī)模也在不斷擴大。近30年來，由于各種植企業(yè)和種植戶相繼從安徽、江蘇、福建等地區(qū)引進了10多批栽培和野生種源，造成施秉太子參種源混雜，質(zhì)量參差不齊。選擇合適、優(yōu)良的種質(zhì)資源進行種植，可以從源頭上保證太子參藥材的品質(zhì)。

本文在前期研究太子參不同栽培類型、不同繁殖方式、不同采收期生物量次生代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化規(guī)律[7-8]和建立太子參種質(zhì)資源圃的基礎(chǔ)上，以多糖和氨基酸含量為營養(yǎng)成分指標(biāo)，對9個太子參種源進行檢測比較，同時考察同一種源在不同環(huán)境和管理下的營養(yǎng)組分的含量變化，旨在為太子參種植中選擇適宜種源提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

9個種源的太子參樣品采集自2012年7月于貴州省施秉縣“貴州三元太寶實業(yè)股份有限公司”的太子參種質(zhì)資源圃(海拔946 m，N 27°08′21.0″，E 107°56′0.10″)。同時以2、5、7號種源為實驗對象，分別考察同一種源在人工管理與自然逸生條件、大田開曠與林下陰蔽環(huán)境、有性與無性種植后藥材多糖與氨基酸含量的差異水平。每份材料分別采集10株塊根，洗凈，≤ 50 ℃烘干，混合粉碎，備用。

表1 實驗材料信息

1.2 儀器和試劑

紫外可見分光光度計(CBC Cintra20型，澳大利亞照生公司)；高效液相色譜儀(日本島津LC-20AD)；電子分析天平(EL-104型，梅特勒-托利多儀器有限公司)。葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-200904)；氨基酸測定試劑包(天津博納艾杰爾科技有限公司，包括：三乙胺，異硫氰酸苯酯，正亮氨酸)，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(天津博納艾杰爾科技有限公司，含17種氨基酸，除胱氨酸為1.25 μmol·mL-1外，其余氨基酸都是2.5 μmol·mL-1)；乙腈(色譜純，Dikma Technologies INC.美國)；無水乙醇、鹽酸、濃硫酸(分析純，上海申博化工有限公司)。

2 方法

2.1 太子參中多糖測定的方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取無水葡萄糖對照品，加蒸餾水制成濃度為44.36 μg·mL-1、35.488 μg·mL-1、26.616 μg·mL-1、17.744 μg·mL-1、8.872 μg·mL-1的對照品溶液，分別取2 mL，依次加入苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，加熱15 min，冰浴10 min，室溫下于490 nm波長下測定。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，得回歸方程：A=0.06X+0.050 1，r=0.999 7。

2.1.2 樣品溶液的制備 精密稱取樣品粗粉0.1 g，用80%乙醇提取1 h，藥渣用蒸餾水90 ℃提取1 h，過濾，藥渣加蒸餾水洗滌數(shù)次，洗液并入濾液，蒸餾水定容于100 mL。再取50 mL加蒸餾水定容于100 mL備用。

2.1.3 多糖的含量測定 精密吸取樣品溶液0.5 mL，加蒸餾水至2.0 mL；吸取兩個不同濃度的對照品溶液2.0 mL，按2.1.1項下，自“依次加入1.0 mL苯酚試液”起操作，并按多糖含量(%)=[(0.0607A-0.0001)× f/W]×100計算。A為樣品測定吸光度平均值，W為樣品稱樣量(g)，f為多糖換算因子(f=2.38)。結(jié)果見表5、圖2。

2.1.4 精密度測定 精密吸取對照品溶液2.0 mL，按2.1.1項下，測定6次，吸光度的RSD 為0.08%，說明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性實驗 精密稱取樣品0.1 g，照2.1.2和2.1.3項下操作，分別于0，30，60，90，150 min測定吸光度。結(jié)果RSD值為3.14%，說明在150 min內(nèi)樣品具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.6 重復(fù)性實驗 精密稱取同一樣品5份，每份0.1 g，照2.1.2和2.1.3項下，測定吸光度。結(jié)果RSD值為3.21%，說明方法的重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收實驗 精密稱取同一產(chǎn)地6份樣品，每份0.05 g，加入適量葡萄糖對照品，照2.1.2和2.1.3項下，測定吸光度。計算結(jié)果見表2。

表2 太子參中多糖成分的加樣回收率試驗

2.2 氨基酸的含量測定

2.2.1 色譜條件 VenusilAA氨基酸分析專用柱(4.6×250 mm，5 μm，柱號：AA952505-0)；以醋酸鈉水溶液為流動相A，以80%乙腈水溶液為流動相B，按表3進行梯度洗脫；檢測波長為254 nm；柱溫為40℃；流速為1.0 mL·min-1。見圖1。

表3 太子參氨基酸成分的梯度洗脫條件表

A.對照品 B.樣品 1.天門冬氨酸(Asp) 2.谷氨酸(Glu) 3.絲氨酸(Ser) 4.甘氨酸(Gly) 5.組氨酸(His) 6.精氨酸(Arg) 7.蘇氨酸(Thr) 8.丙氨酸(Ala) 9.脯氨酸(Pro) 10.酪氨酸(Tyr) 11.纈氨酸(Val) 12.蛋氨酸(Met) 13.胱氨酸(Cys) 14.異亮氨酸(Ile) 15.亮氨酸(Leu) 16.正亮氨酸(Nle，內(nèi)標(biāo)物) 17-苯丙氨酸(Phe) 18賴氨酸(Lys)圖1 太子參氨基酸高效液相色譜圖譜

2.2.2 樣品處理 取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置安瓿瓶中，精密加入0.1%苯酚的6 moL·L-1鹽酸10 mL，110 ± 1 ℃水解24 h，取出過濾，取濾液5 mL蒸干，殘渣加蒸餾水5.0 mL溶解，用0.45 μm濾膜過濾后，備用。

2.2.3 衍生化反應(yīng) 精密量取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液2.0 mL，加正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液0.20 mL，三乙胺乙腈溶液1 mL、異硫氰酸苯酯乙腈溶液1.0 mL，室溫放置3 h，然后加入正己烷4.0 mL，放置10 min，取下層溶液，用0.45 μm濾膜過濾，取濾液2.0 mL，加水定容至10 mL，即得。2.2.4 測定 精密吸取對照品溶液、供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀測定。氨基酸含量(%)=f1C V×10-4/f2W。f1=樣品溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)物峰面積；f2=氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中各氨基酸峰面積∕內(nèi)標(biāo)物峰面積；C=氨基酸對照品濃度(μg·mL-1)，V=樣品溶液定容體積，W=樣品質(zhì)量(g)。結(jié)果見表5、圖3。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、350 μL、400 μL按2.2.3和2.2.4項下測定。以各氨基酸峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，進行線性回歸。除胱氨酸在0.125～0.500 μmoL·mL-1外，其余氨基酸在0.25～1.00 μmoL·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。17種氨基酸的線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)r值見表4。

表4 17種氨基酸的線性回歸方程及r值

2.2.6 精密度測定 取氨基酸對照品溶液，連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖。計算各氨基酸的峰面積，結(jié)果RSD為1.72%～4.02%，表明精密度良好。

2.2.7 重現(xiàn)性試驗 取同一樣品5 份，精密稱定，按2.2.2和2.2.3 項下處理后測定，計算各氨基酸的峰面積，結(jié)果RSD值為0.75%～3.01%，重現(xiàn)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取衍生后的樣品溶液，放置0，2，4，6，8，10，12 h，分別測定，計算各氨基酸的峰面積，結(jié)果RSD值為1.08%～2.94%，說明樣品至少在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗 稱取已知含量的太子參粉末0.25 g，按2.2.2、2.2.3項方法分別提取、衍生、進樣，平行5次，計算各氨基酸的回收率。結(jié)果，17種游離氨基酸的平均回收率在86.25%～108.04%之間，RSD值在1.24%～2.93%之間。

表5 不同種源太子參中多糖和氨基酸的含量 /%

注：*人體必需氨基酸；**總氨基酸含量為以上各氨基酸含量之和

圖2 不同種源太子參多糖含量均值比較圖

圖3 不同種源太子參總氨基酸含量均值、必需氨基酸含量均值比較圖

3 結(jié)果與討論

藥用植物中的多糖類化合物具有多種藥理作用和生理活性，可作為滋補類中藥的質(zhì)量評價指標(biāo)，有研究認為多糖的含量與藥材表面顏色、飽滿度有一定相關(guān)性[9，10]，多糖含量高的藥材性狀飽滿、光亮。本文測定的9個種源太子參塊根中的多糖含量為18.38%～64.95%，RSD值達到31.84%，表明種源間藥材中多糖含量的差異比較大。其中SB-02(貴州施秉，逸生)、SB-03(貴州施秉，栽培)和XZ-01(安徽宣州，栽培)多糖含量超過50%，明顯高于其他種源的多糖含量。說明盡管施秉不是太子參的傳統(tǒng)產(chǎn)地，也沒有野生太子參分布的記載，但現(xiàn)在市場上施秉太子參藥材品相得到廣泛認可，可能與其多糖含量高有關(guān)；同時也說明施秉逸生和安徽種源是太子參良種篩選的潛在材料。

本文以SB-02(貴州施秉，逸生)植株和SB-03(貴州施秉，大田)植株為例，考查了同一種源在不同管理模式下塊根中多糖含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SB-03(貴州施秉，大田)塊根不僅多糖含量高于SB-02(貴州施秉，逃逸)，而且塊根數(shù)與植株形態(tài)遠甚于自然生境中的樣本，表明科學(xué)的人工管理可大幅促進太子參多糖成分的積累和提高產(chǎn)量；以JR-03(江蘇句容，林下)與JR-02(江蘇句容，大田)種源為例，考查了同一種源引種后在不同生境中的多糖含量變化，結(jié)果顯示處于較遮陰環(huán)境的JR-04樣本的多糖含量不僅明顯高于開闊生境的JR-02樣本，而且生長期延長，倒苗時間較后者植株延后約12～15 d。林光美等人研究認為[11]，適當(dāng)?shù)恼陉幠軌蜓娱L太子參植株的生長期，可提高種植產(chǎn)量10%，本文的實驗和檢測結(jié)果與之一致，說明生境的適宜程度能影響太子參產(chǎn)量和質(zhì)量，比如適當(dāng)?shù)恼陉幠軌蛟黾又仓甓嗵堑姆e累；本文還發(fā)現(xiàn)XZ-02(安徽宣州，有性繁殖)有性繁殖塊根的多糖含量比XZ-01(安徽宣州，無性繁殖)無性繁殖塊根的略低，但差別不顯著，表明不同繁殖材料都是適于人工種植方式的。

氨基酸是動植物體內(nèi)合成生物蛋白質(zhì)的主要原料，也是主要的營養(yǎng)成分，某些氨基酸還能夠參與機體內(nèi)的代謝，在基因表達控制方面和激素一樣起著重要的作用。由于大多數(shù)氨基酸缺乏天然的紫外或熒光吸收，衍生色譜法測定氨基酸的含量已經(jīng)成為一種趨勢，利用異硫氰酸苯酯(PITC)和氨基酸的衍生反應(yīng)，生成穩(wěn)定的產(chǎn)物苯基硫酸鹽(PTC)-氨基酸，是柱前衍生化測定氨基酸含量的最具有吸引力的分析方法之一[12，13]。由于衍生化反應(yīng)時間對于測定的穩(wěn)定性有較大影響，本實驗對衍生化反應(yīng)時間進行了試驗，結(jié)果表明，衍生化時間應(yīng)大于2.5 h，本文測定時的衍生化反應(yīng)時間規(guī)定為3 h。

本文測定的9個種源12份材料的17種氨基酸，其中人體必需氨基酸8種。結(jié)果顯示，9個種源藥材的總氨基酸的含量為9.66%～11.95%，RSD值5.81%，人體必需氨基酸(8種)含量為3.19%～4.11%，RSD值7.69%，表明種源間總氨基酸和必需氨基酸含量差異不大。但17種氨基酸在9個種源12份材料中的含量差異大小不一，RSD值從4.10%至32.17%。同時，在考察不同生境對同一種源影響時，發(fā)現(xiàn)SB-02(貴州施秉，逸生)和SB-03(貴州施秉，大田)、JR-03(江蘇句容，大田)和JR-04(江蘇句容，林下)這2種種源中17種氨基酸總含量和必須氨基酸的含量也基本一致，即同一種源的氨基酸類組分與含量受生態(tài)環(huán)境的影響不大。但考查同一種源不同繁殖方式的氨基酸含量水平，結(jié)果顯示XZ-02(安徽宣州，有性繁殖)的氨基酸的含量要高于XZ-01(安徽宣州，無性繁殖)。提示太子參氨基酸含量與種源和環(huán)境的關(guān)系不大，而與繁殖方式有一定的關(guān)系。比較有性繁殖和無性繁殖的植株生長過程發(fā)現(xiàn)，有性繁殖幼苗較無性繁殖幼苗弱，兩種繁殖方式的植株生長后期逐漸趨于一致，而最后產(chǎn)量相當(dāng)，提示有性繁殖種苗在生長過程中應(yīng)該有較高的生理代謝活動，因此氨基酸的含量較高。至于再利用F1塊根進行無性繁殖后，氨基酸含量是否會降低，有待于進一步的觀察。

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Comparative analysis of polysaccharide and amino acid content in different provenances of Pesudostellaria heterophylla from Guizhou Province

YANG Changgui1，JIANG Weike1*，ZHOU Tao1，Xiao Chenghong，AI Qiang，ZHANG Daijin2

(1.GuiyangcollegeofTraditionalChineseMedicine，Guiyang550002，China；2.GuizhouSanyuanTaibaoCo.，Ltd.，Shibing556200，China)

Objective：To study the main influence factors of Pseudostellariae Radix quality by determining polysaccharide and amino acid inPesudostellariaheterophyllafrom 9 different provenances and cultivation way.Methods：The determination of polysaccharide used colorimetric method，the content of 17 kinds of amino acid used pre-column derivatization RP-HPLC method.Results：The contents of polysaccharide in the 9 different provenances had great difference，but the contents of amino acid had little difference.Conclusion：The contents of polysaccharide could be used as the best selection standards forP.heterophyllabreeding.

Pesudostellariaheterophylla；Provenances；Polysaccharide content；Amino acid content

施秉中藥材產(chǎn)業(yè)科技合作專項計劃(施科合專項(20010)02號、(2012)04號)；貴州省教育廳自然科學(xué)項目(黔教科(2011)031號)；中央本級重大增減支項目(20603020120，20603020223)；貴陽市科技計劃項目(筑科合同[2011201]大—3號、[2012]3號)；貴陽中醫(yī)學(xué)院研究生教育創(chuàng)新計劃項目(ZYYCX11033)

*[通信作者] 江維克，教授，研究方向：中藥資源、中藥栽培及中藥質(zhì)量評價，Tel：(0851)5622506，E-mail：jwk_88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.010

2013-05-20)