我國(guó)北部灣部分海產(chǎn)品中副溶血弧菌的基因分型研究

韋強(qiáng)+李毅財(cái)

摘要利用RAPD技術(shù)對(duì)北部灣分離的24株Vp進(jìn)行基因分型。結(jié)果顯示：RAPD可以分離出7~11條不同的條帶，大小0.45~1.50 kb。聚類分析結(jié)果表明在相似度為0.84時(shí)，RAPD分辨力指數(shù)為0.931。采用通過(guò)POPGENE 32軟件對(duì)比了24株Vp的各種遺傳參數(shù)，結(jié)果表明：RAPD的Shannon信息指數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei基因多樣性分別為0.561 6、1.681 6和0.382 3。表明RAPD能較好地研究Vp的分子遺傳特征，適合于區(qū)分不同來(lái)源的Vp菌株。

關(guān)鍵詞海產(chǎn)品；副溶血弧菌；基因分型；RAPD；聚類分析；北部灣

中圖分類號(hào)Q789文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739（2014）11-0273-02

ResearchonGenotypingofVibrioparahaemolyticusinSeafoodinPartofChineseBeibuGulf

WEI Qiang 1LI Yi-cai 2

（1 Luobu Town Yufeng District Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Station of Liuzhou City in Guangxi Zhuang Autonomous Region 545011；

2 Laibin Animal Product Quality and Safety Testing Center）

AbstractGenotyping 24 strains of Vp from Beibu Gulf were conducted using RAPD. The results showed that RAPD yielded 7 to 11 distinct bands with the size range between 0.45 kb and 1.50 kb. Cluster analysis showed that with the coefficient more than 0.84，RAPD resolution index was 0.931. Using POPGENE 32 software compared to the parameters of various genetic 24 strains of Vp，results showed that the Shannon information index（I），effective number of alleles per locus（Ne），Nei′s gene diversity index（H）of RAPD were 0.561 6，1.681 6 and 0.382 3，respectively. The results showed that the RAPD method was sensitive to distinguish reflect the molecular genetic characteristics Vp strains.

Key wordsseafood；Vibrio parahaemolyticus；genotype；RAPD；clustering analysis；Beibu Gulf

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）的傳統(tǒng)分型方法是血清分型，主要是利用菌體的O抗原和莢膜的K抗原對(duì)細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。但是該方法也存在不少缺點(diǎn)：分辨力有限，且人為因素干擾嚴(yán)重，尤其在突發(fā)公共衛(wèi)生事件需要病原進(jìn)行溯源時(shí)難以滿足準(zhǔn)確、快速追蹤的需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因分型技術(shù)已越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于病源微生物的檢測(cè)和流行病學(xué)的研究中。用分子分型技術(shù)從分子水平上研究Vp的變化情況，能更好地了解不同地區(qū)Vp之間的親緣關(guān)系以及遺傳關(guān)系變化情況，也有利于追蹤Vp感染的源頭，從而更好地預(yù)防和控制Vp引起的食物中毒等事件的發(fā)生[1]。

通過(guò)從我國(guó)北部灣4個(gè)海區(qū)不同采樣點(diǎn)采集的不同貝類樣品中分離的Vp，利用RAPD方法，分析了不同來(lái)源菌株間的種類、遺傳參數(shù)，比較了Vp菌株的指紋圖譜的相似度，以便了解不同地區(qū)貝類產(chǎn)品中不同菌株的遺傳變異程度和考察菌株間的差異和地理來(lái)源的關(guān)系。以此為基礎(chǔ)探討RAPD分型技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，為深入了解Vp的分子生物學(xué)特征提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株來(lái)源。分別從我國(guó)北部灣湛江港、防城港，欽州港和北海港采集貝類樣品（牡蠣、扇貝、菲律賓蛤仔、毛蚶、貽貝、縊蟶），并分離菌株，采用MPN-PCR[2]方法檢測(cè)，確定為Vp菌株，共從中挑選出的24株，菌株的來(lái)源（表1）。

1.1.2試劑。TaqDNA聚合酶，10×Buffer，2.5 mmol/L dNTPs，DNA Maker，6×Loading Buffer購(gòu)自TAKARA公司；Gene Finder核酸染料，購(gòu)自廈門百維信生物科技有限公司；RAPD引物序列為：5′-CAGGCGCACA-3′，均由華大基因合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1副溶血弧菌基因組DNA的提取。參照文獻(xiàn)[3]和《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的CTAB法提取副溶血弧菌分離株基因組DNA。

1.2.2RAPD反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)。RAPD的反應(yīng)體系（表2），PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，后45個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)包括（94 ℃變性，1 min，36 ℃連接1 min 30 s，72 ℃延伸2 min 30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物與Gene Finder核酸染料混合后，經(jīng)1.5%的瓊脂糖點(diǎn)樣，90 V電泳120 min，凝膠成像系統(tǒng)成像并拍照。

1.3數(shù)據(jù)處理

DNA指紋分析的結(jié)果是二元性狀的圖，即在同一位置上的帶屬于同一個(gè)位點(diǎn)，有帶的記為1，無(wú)帶的記為0。所得的位點(diǎn)按分子量從大到小排列。應(yīng)用POPGENE 32軟件對(duì)28個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳參數(shù)計(jì)算。其中有：①反映基因多少和狀況的遺傳參數(shù)：觀測(cè)等位基因數(shù)（Na，Observed number of alleles）和有效等位基因數(shù)（Ne，Effective number of alleles）（Kimura and Crow，1964）；②反映基因多樣性信息的遺傳參數(shù)，Nei基因多樣性（H，Nei′s gene diversity）和Shannon信息指數(shù)（I，Shannon′s Information index，Lewontin 1972）。

數(shù)據(jù)用NTSYS pc2.10e軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并選定UPGMA（Unweighted pair group method using arithmetic average，非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法）聚類方法，自動(dòng)生成聚類圖。分辨力指數(shù)（D）按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

D=1-■■nj（nj-1）

其中N為樣本數(shù)，s為能區(qū)分的類型數(shù)，nj為屬于j類型的樣本數(shù)量。

2結(jié)果與分析

2.1RAPD電泳圖譜分析

電泳結(jié)果如圖1所示，表明RAPD擴(kuò)增的條帶在450~1 500 bp，擴(kuò)增的條帶為7~11條，條帶清晰明亮，多態(tài)性高。

2.2RAPD遺傳參數(shù)分析

POPGENE 32軟件對(duì)24株菌進(jìn)行分析結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明：Shannon信息指數(shù)（Ⅰ）為0.561 6，說(shuō)明各個(gè)菌株間個(gè)體分配的均勻性差異較大；等位基因觀察數(shù)（Na）為2.000；有效等位基因數(shù)（Ne）為1.681 6；Nei′s基因多樣性指數(shù)（H）為0.382 3。Nei′s基因多樣性指數(shù)相對(duì)較高達(dá)到0.382 3，說(shuō)明Vp群體間交流頻繁，產(chǎn)生了遺傳多樣性。

2.3RAPD聚類分析

根據(jù)RAPD電泳圖譜，用NTSYS pc2.10e軟件對(duì)24株菌的遺傳關(guān)系進(jìn)行聚類分析（圖2）。從遺傳相似性系數(shù)可知，Vp種間相似性系數(shù)變化較大。聚類結(jié)果表明，在0.84相似度時(shí)，24株菌可分成16個(gè)群，分辨力指數(shù)為0.931。

3討論

3.1RAPD優(yōu)缺點(diǎn)

RAPD技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)成本低，可以通過(guò)未知的DNA模板序列信息的條件下，采用幾個(gè)較短的隨機(jī)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增基因組DNA模板的任意部分，從而可以對(duì)整個(gè)群落進(jìn)行描繪等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)倍受重視，并已被廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性的研究[4]。但是RAPD技術(shù)缺點(diǎn)表現(xiàn)在易受外界因素影響，重復(fù)性較差。而且由于RAPD對(duì)于由幾個(gè)相同堿基組成的序列不能區(qū)分出來(lái)，因此對(duì)物種的相似性估計(jì)有偏大的趨勢(shì)，這個(gè)是RAPD的最大不足之處。

3.2Vp分型方法比較

試驗(yàn)中采用RAPD技術(shù)對(duì)24株Vp分型進(jìn)行結(jié)果因此RAPD技術(shù)比較適合對(duì)大規(guī)模的Vp的分型研究。根據(jù)RAPD展現(xiàn)出Vp不同菌株間多態(tài)性，比較其遺傳相似度后發(fā)現(xiàn)：不同地點(diǎn)采集的Vp具有豐富的遺傳多樣性。有些表現(xiàn)出遺傳相似度較高，表明他們具有更近的親緣關(guān)系，同時(shí)也表明，菌株的遺傳相似性與地理位置、宿主等有一定的相關(guān)性。這個(gè)結(jié)論與蘇婷等[5]采用DGGE技術(shù)調(diào)查廣州南海海區(qū)Vp的多態(tài)性結(jié)果類似。

RAPD產(chǎn)生的條帶明亮、清晰，方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，便于快速檢驗(yàn)，因此就本次研究來(lái)說(shuō)RAPD比較適合對(duì)Vp菌株進(jìn)行分型。DGGE技術(shù)具有良好的分辨率，可以達(dá)到1個(gè)堿基差異的水平，因此要是RAPD能結(jié)合DGGE技術(shù)，就能各自發(fā)揮各自的優(yōu)點(diǎn)。Bahieldin等[6]在2006年采用RAPD-DGGE技術(shù)研究4種大麥時(shí)，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)組合能克服RAPD在應(yīng)用于植物的遺傳分析試驗(yàn)，例如低水平的重復(fù)性和多態(tài)性，同時(shí)具有高的結(jié)果重現(xiàn)性，更高水平的多態(tài)性，因此是一種相互結(jié)合的良好的DNA分析技術(shù)。

4參考文獻(xiàn)

[1] 鐘凱.副溶血弧菌的快速檢驗(yàn)與應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2005，6（1）：75-78.

[2] 曹慧慧.國(guó)內(nèi)主要沿海城市零售貝類中副溶血性弧菌的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2010.

[3] YANG Z Q，JIAO X A，ZHOU X H，et al.Isolation and molecu-lar characterization of Vibrio parahaemolyticus from fresh，low- temperature preserved，dried，and salted seafood products in two coastal areas of eastern China[J].International Journal of Food Microbiology，2008，25（3）：279-285.

[4] 張俊彥，梅玲玲，朱敏，等.301份海水產(chǎn)品副溶血性弧菌定量檢測(cè)分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（3）：509-510.

[5] 蘇婷，羅鵬.34株副溶血弧菌16S-23SrDNA間區(qū)多態(tài)性DGGE分析[J].熱帶海洋學(xué)報(bào)，2010，3（29）：55-60.

[6] BAHIELDIN A，AHMED I A，GADELKARIM G A.DGGE-RAPD analysis as a useful tool for cultivar identification[J].African Journal of Biotechno-logy，2006，5（8）：566-569.

2.1RAPD電泳圖譜分析

電泳結(jié)果如圖1所示，表明RAPD擴(kuò)增的條帶在450~1 500 bp，擴(kuò)增的條帶為7~11條，條帶清晰明亮，多態(tài)性高。

2.2RAPD遺傳參數(shù)分析

POPGENE 32軟件對(duì)24株菌進(jìn)行分析結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明：Shannon信息指數(shù)（Ⅰ）為0.561 6，說(shuō)明各個(gè)菌株間個(gè)體分配的均勻性差異較大；等位基因觀察數(shù)（Na）為2.000；有效等位基因數(shù)（Ne）為1.681 6；Nei′s基因多樣性指數(shù)（H）為0.382 3。Nei′s基因多樣性指數(shù)相對(duì)較高達(dá)到0.382 3，說(shuō)明Vp群體間交流頻繁，產(chǎn)生了遺傳多樣性。

2.3RAPD聚類分析

根據(jù)RAPD電泳圖譜，用NTSYS pc2.10e軟件對(duì)24株菌的遺傳關(guān)系進(jìn)行聚類分析（圖2）。從遺傳相似性系數(shù)可知，Vp種間相似性系數(shù)變化較大。聚類結(jié)果表明，在0.84相似度時(shí)，24株菌可分成16個(gè)群，分辨力指數(shù)為0.931。

3討論

3.1RAPD優(yōu)缺點(diǎn)

RAPD技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)成本低，可以通過(guò)未知的DNA模板序列信息的條件下，采用幾個(gè)較短的隨機(jī)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增基因組DNA模板的任意部分，從而可以對(duì)整個(gè)群落進(jìn)行描繪等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)倍受重視，并已被廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性的研究[4]。但是RAPD技術(shù)缺點(diǎn)表現(xiàn)在易受外界因素影響，重復(fù)性較差。而且由于RAPD對(duì)于由幾個(gè)相同堿基組成的序列不能區(qū)分出來(lái)，因此對(duì)物種的相似性估計(jì)有偏大的趨勢(shì)，這個(gè)是RAPD的最大不足之處。

3.2Vp分型方法比較

試驗(yàn)中采用RAPD技術(shù)對(duì)24株Vp分型進(jìn)行結(jié)果因此RAPD技術(shù)比較適合對(duì)大規(guī)模的Vp的分型研究。根據(jù)RAPD展現(xiàn)出Vp不同菌株間多態(tài)性，比較其遺傳相似度后發(fā)現(xiàn)：不同地點(diǎn)采集的Vp具有豐富的遺傳多樣性。有些表現(xiàn)出遺傳相似度較高，表明他們具有更近的親緣關(guān)系，同時(shí)也表明，菌株的遺傳相似性與地理位置、宿主等有一定的相關(guān)性。這個(gè)結(jié)論與蘇婷等[5]采用DGGE技術(shù)調(diào)查廣州南海海區(qū)Vp的多態(tài)性結(jié)果類似。

RAPD產(chǎn)生的條帶明亮、清晰，方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，便于快速檢驗(yàn)，因此就本次研究來(lái)說(shuō)RAPD比較適合對(duì)Vp菌株進(jìn)行分型。DGGE技術(shù)具有良好的分辨率，可以達(dá)到1個(gè)堿基差異的水平，因此要是RAPD能結(jié)合DGGE技術(shù)，就能各自發(fā)揮各自的優(yōu)點(diǎn)。Bahieldin等[6]在2006年采用RAPD-DGGE技術(shù)研究4種大麥時(shí)，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)組合能克服RAPD在應(yīng)用于植物的遺傳分析試驗(yàn)，例如低水平的重復(fù)性和多態(tài)性，同時(shí)具有高的結(jié)果重現(xiàn)性，更高水平的多態(tài)性，因此是一種相互結(jié)合的良好的DNA分析技術(shù)。

4參考文獻(xiàn)

[1] 鐘凱.副溶血弧菌的快速檢驗(yàn)與應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2005，6（1）：75-78.

[2] 曹慧慧.國(guó)內(nèi)主要沿海城市零售貝類中副溶血性弧菌的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2010.

[3] YANG Z Q，JIAO X A，ZHOU X H，et al.Isolation and molecu-lar characterization of Vibrio parahaemolyticus from fresh，low- temperature preserved，dried，and salted seafood products in two coastal areas of eastern China[J].International Journal of Food Microbiology，2008，25（3）：279-285.

[4] 張俊彥，梅玲玲，朱敏，等.301份海水產(chǎn)品副溶血性弧菌定量檢測(cè)分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（3）：509-510.

[5] 蘇婷，羅鵬.34株副溶血弧菌16S-23SrDNA間區(qū)多態(tài)性DGGE分析[J].熱帶海洋學(xué)報(bào)，2010，3（29）：55-60.

[6] BAHIELDIN A，AHMED I A，GADELKARIM G A.DGGE-RAPD analysis as a useful tool for cultivar identification[J].African Journal of Biotechno-logy，2006，5（8）：566-569.

2.1RAPD電泳圖譜分析

電泳結(jié)果如圖1所示，表明RAPD擴(kuò)增的條帶在450~1 500 bp，擴(kuò)增的條帶為7~11條，條帶清晰明亮，多態(tài)性高。

2.2RAPD遺傳參數(shù)分析

POPGENE 32軟件對(duì)24株菌進(jìn)行分析結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明：Shannon信息指數(shù)（Ⅰ）為0.561 6，說(shuō)明各個(gè)菌株間個(gè)體分配的均勻性差異較大；等位基因觀察數(shù)（Na）為2.000；有效等位基因數(shù)（Ne）為1.681 6；Nei′s基因多樣性指數(shù)（H）為0.382 3。Nei′s基因多樣性指數(shù)相對(duì)較高達(dá)到0.382 3，說(shuō)明Vp群體間交流頻繁，產(chǎn)生了遺傳多樣性。

2.3RAPD聚類分析

根據(jù)RAPD電泳圖譜，用NTSYS pc2.10e軟件對(duì)24株菌的遺傳關(guān)系進(jìn)行聚類分析（圖2）。從遺傳相似性系數(shù)可知，Vp種間相似性系數(shù)變化較大。聚類結(jié)果表明，在0.84相似度時(shí)，24株菌可分成16個(gè)群，分辨力指數(shù)為0.931。

3討論

3.1RAPD優(yōu)缺點(diǎn)

RAPD技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)成本低，可以通過(guò)未知的DNA模板序列信息的條件下，采用幾個(gè)較短的隨機(jī)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增基因組DNA模板的任意部分，從而可以對(duì)整個(gè)群落進(jìn)行描繪等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)倍受重視，并已被廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性的研究[4]。但是RAPD技術(shù)缺點(diǎn)表現(xiàn)在易受外界因素影響，重復(fù)性較差。而且由于RAPD對(duì)于由幾個(gè)相同堿基組成的序列不能區(qū)分出來(lái)，因此對(duì)物種的相似性估計(jì)有偏大的趨勢(shì)，這個(gè)是RAPD的最大不足之處。

3.2Vp分型方法比較

試驗(yàn)中采用RAPD技術(shù)對(duì)24株Vp分型進(jìn)行結(jié)果因此RAPD技術(shù)比較適合對(duì)大規(guī)模的Vp的分型研究。根據(jù)RAPD展現(xiàn)出Vp不同菌株間多態(tài)性，比較其遺傳相似度后發(fā)現(xiàn)：不同地點(diǎn)采集的Vp具有豐富的遺傳多樣性。有些表現(xiàn)出遺傳相似度較高，表明他們具有更近的親緣關(guān)系，同時(shí)也表明，菌株的遺傳相似性與地理位置、宿主等有一定的相關(guān)性。這個(gè)結(jié)論與蘇婷等[5]采用DGGE技術(shù)調(diào)查廣州南海海區(qū)Vp的多態(tài)性結(jié)果類似。

RAPD產(chǎn)生的條帶明亮、清晰，方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，便于快速檢驗(yàn)，因此就本次研究來(lái)說(shuō)RAPD比較適合對(duì)Vp菌株進(jìn)行分型。DGGE技術(shù)具有良好的分辨率，可以達(dá)到1個(gè)堿基差異的水平，因此要是RAPD能結(jié)合DGGE技術(shù)，就能各自發(fā)揮各自的優(yōu)點(diǎn)。Bahieldin等[6]在2006年采用RAPD-DGGE技術(shù)研究4種大麥時(shí)，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)組合能克服RAPD在應(yīng)用于植物的遺傳分析試驗(yàn)，例如低水平的重復(fù)性和多態(tài)性，同時(shí)具有高的結(jié)果重現(xiàn)性，更高水平的多態(tài)性，因此是一種相互結(jié)合的良好的DNA分析技術(shù)。

4參考文獻(xiàn)

[1] 鐘凱.副溶血弧菌的快速檢驗(yàn)與應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2005，6（1）：75-78.

[2] 曹慧慧.國(guó)內(nèi)主要沿海城市零售貝類中副溶血性弧菌的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2010.

[3] YANG Z Q，JIAO X A，ZHOU X H，et al.Isolation and molecu-lar characterization of Vibrio parahaemolyticus from fresh，low- temperature preserved，dried，and salted seafood products in two coastal areas of eastern China[J].International Journal of Food Microbiology，2008，25（3）：279-285.

[4] 張俊彥，梅玲玲，朱敏，等.301份海水產(chǎn)品副溶血性弧菌定量檢測(cè)分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（3）：509-510.

[5] 蘇婷，羅鵬.34株副溶血弧菌16S-23SrDNA間區(qū)多態(tài)性DGGE分析[J].熱帶海洋學(xué)報(bào)，2010，3（29）：55-60.

[6] BAHIELDIN A，AHMED I A，GADELKARIM G A.DGGE-RAPD analysis as a useful tool for cultivar identification[J].African Journal of Biotechno-logy，2006，5（8）：566-569.