分光光度法測定水中葉綠素a的方法研究

劉暢

摘要按照《國家環(huán)境污染物監(jiān)測方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則（HJ168-2010）》的規(guī)定，確立分光光度法測定水中葉綠素a的特性指標(biāo)，為本方法國家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。結(jié)果表明：方法的檢出限為0.094 mg/m3，精密度為5.87%~9.84%，空白加標(biāo)回收率為83.8%~92.0%，實際樣品加標(biāo)回收率為80.2%~87.0%。同時提出試驗過程中的注意事項和關(guān)鍵點。

關(guān)鍵詞分光光度法；葉綠素a；測定方法；特性指標(biāo)；注意事項

中圖分類號O657.31文獻標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739（2014）11-0238-01

ResearchonDeterminationofChlorophyllainWaterbySpectrophotometricMethod

LIU Chang

（Liaoning Environment Monitoring Center，Shenyang Liaoning 110161）

AbstractAccording to the Technical Guidelines for Development and Revision of National Environmental Monitoring Methods and Standards（HJ168-2010），characteristic factors of Chlorophyll a determinated by Spectrophotometric method was established which providing basis for the establishment of the national standard. The results were as follows：The detection limit and relative standard deviation were 0.094 mg/m3 and 5.87%~9.84%，respectively，and the blank standard addition recovery and the sample standard addition recovery were 83.8%~92.0% and 80.2%~87.0%，respectively.The points for attention and the key points were provided.

Key wordsspectrophotometric method；Chlorophyll a；detection method；characteristic factors；points for attention

葉綠素a是評價湖泊富營養(yǎng)化的重要參數(shù)[1]，我國尚無國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法，目前葉綠素a監(jiān)測的主要依據(jù)是《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》[2]中的分光光度法，該方法是B類方法，經(jīng)過國內(nèi)的研究和多個單位的實驗驗證表明是成熟的統(tǒng)一方法，有待上升為國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法，但該方法未明確檢出限、精密度和準(zhǔn)確度等一系列方法特性指標(biāo)，本文以《國家環(huán)境污染物監(jiān)測方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則（HJ168-2010）》[3]為依據(jù)，通過試驗確立本方法的特性指標(biāo)，并結(jié)合日常工作經(jīng)驗提出本方法試驗過程中的注意事項和關(guān)鍵點，為國標(biāo)方法的建立以及分析人員的日常檢測工作提供參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：紫外-可見分光光度計、離心機、抽濾裝置、研缽、0.45 μm乙酸纖維濾膜。試劑：葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品（CAS NO：479-61-8）、90%丙酮溶液、碳酸鎂粉末。

1.2試驗方法

1.2.1過濾。在抽濾器上裝好乙酸纖維濾膜。倒入定量體積的水樣進行抽濾，抽濾時負壓不能過大（約為50 kPa）。水樣抽完后，繼續(xù)抽1～2 min，以減少濾膜上的水分，該過程需在避光條件下完成[4-5]。

1.2.2提取。將濾膜放入研缽中，加入少量碳酸鎂粉末及2~3 mL 90%丙酮，充分研磨，提取葉綠素a。用離心機（3 000~4 000 r/min）離心10 min（可根據(jù)樣品的濃度和濁度適當(dāng)延長離心時間），將上清液倒入10 mL容量瓶中，再加2~3 mL 90%丙酮，繼續(xù)研磨提取，離心10 min，并將上清液再轉(zhuǎn)入容量瓶中，重復(fù)1~2次，用90%丙酮定容為10 mL，搖勻。

1.2.3測定。取上清液于1 cm光程的比色皿，分別讀取750、663、645、630 nm波長的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度測定，對樣品吸光度進行校正。

2結(jié)果與分析

2.1檢出限

按照HJ168-2010[3]的規(guī)定，對葉綠素a濃度為0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品進行測定，計算7次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照下式計算方法檢出限：

MDL=t（n-1，0.99）×S

式中：MDL為檢出限；n為樣品的平行測定次數(shù)；t為自由度為n-1且置信度為99%時的t分布（單側(cè)）（n=7時，t=3.143）；S為n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)果表明，7次測定結(jié)果分別為0.455、0.408、0.437、0.361、0.417、0.434、0.424 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）為0.030，檢出限為0.094 mg/L。因此，葉綠素a的檢出限為0.094 mg/L，當(dāng)提取液定容體積為10 mL，水樣量為1 000 mL時，葉綠素a 的檢出限為0.94 mg/m3。

2.2準(zhǔn)確度

由于目前沒有葉綠素a的標(biāo)準(zhǔn)樣品，因此以加標(biāo)回收率考察方法的準(zhǔn)確性[6]。本試驗分別以空白加標(biāo)和實際樣品加標(biāo)對方法的準(zhǔn)確度進行考察，加標(biāo)方法為對實際樣品抽濾后，在研磨濾膜時加入葉綠素a標(biāo)液，按照樣品分析的全過程進行分析，空白加標(biāo)以純水代替實際樣品，其余操作過程與實際樣品相同，測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明：空白樣品的加標(biāo)回收率為83.8%~92.0%，實際樣品的加標(biāo)回收率為80.2%~87.0%，該方法的加標(biāo)回收率較低，主要是因為研磨過程中葉綠素a的損失較大，如何減少損失、提高樣品分析的準(zhǔn)確性將有待進一步研究。

2.3精密度

對不同濃度的實際樣品平行測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的精密度，測定結(jié)果見表2。從測定結(jié)果可以看出，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.87%~9.84%。

3結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，本方法的檢出限為0.094 mg/m3，空白加標(biāo)回收率為83.8%~92.0%，實際樣品加標(biāo)回收率為80.2%~87.0%，精密度為5.87%~9.84%。據(jù)此提出試驗過程中的注意事項和關(guān)鍵點：一是樣品過濾前需充分搖勻，以免產(chǎn)生誤差；二是使用的玻璃器皿和比色皿均應(yīng)清潔、干燥、無酸，不要用酸浸泡或洗滌；三是如波長750 nm處的吸光度大于0.005，應(yīng)將溶液再次（或多次）充分離心后測定吸光度，需要多次離心時，不可用原離心管繼續(xù)離心，需將溶液轉(zhuǎn)移至清潔干燥離心管中；四是因為葉綠素提取液對光敏感，故整個試驗過程要盡量在微弱的光照下進行。

4參考文獻

[1] 屠清英.湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范[M].2版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，1990：268-270.

[2] 國家環(huán)境保護總局.水和廢水監(jiān)側(cè)分析方法[M].4版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：670.

[3] HJ 168-2010環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則[S].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2010.

[4] 高岐，趙旭光，譚煜媚.分光光度法測定-超聲波提取植物韭菜中葉綠素含量的研究[J].食品工業(yè)科技，2007（8）：166-167.

[5] 湯燦輝，黃潔，肖美鳳，等.淺談用分光光度法測定蟲茶中葉綠素的含量[J].求醫(yī)問藥，2012，10（11）：873-874.

[6] 周靜，胡忠軍，李培培，等.基于葉綠素a測定的分光光度法與bbe法比較：以千島湖為例[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2013，34（2）：80-84.

摘要按照《國家環(huán)境污染物監(jiān)測方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則（HJ168-2010）》的規(guī)定，確立分光光度法測定水中葉綠素a的特性指標(biāo)，為本方法國家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。結(jié)果表明：方法的檢出限為0.094 mg/m3，精密度為5.87%~9.84%，空白加標(biāo)回收率為83.8%~92.0%，實際樣品加標(biāo)回收率為80.2%~87.0%。同時提出試驗過程中的注意事項和關(guān)鍵點。

關(guān)鍵詞分光光度法；葉綠素a；測定方法；特性指標(biāo)；注意事項

中圖分類號O657.31文獻標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739（2014）11-0238-01

ResearchonDeterminationofChlorophyllainWaterbySpectrophotometricMethod

LIU Chang

（Liaoning Environment Monitoring Center，Shenyang Liaoning 110161）

AbstractAccording to the Technical Guidelines for Development and Revision of National Environmental Monitoring Methods and Standards（HJ168-2010），characteristic factors of Chlorophyll a determinated by Spectrophotometric method was established which providing basis for the establishment of the national standard. The results were as follows：The detection limit and relative standard deviation were 0.094 mg/m3 and 5.87%~9.84%，respectively，and the blank standard addition recovery and the sample standard addition recovery were 83.8%~92.0% and 80.2%~87.0%，respectively.The points for attention and the key points were provided.

Key wordsspectrophotometric method；Chlorophyll a；detection method；characteristic factors；points for attention

葉綠素a是評價湖泊富營養(yǎng)化的重要參數(shù)[1]，我國尚無國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法，目前葉綠素a監(jiān)測的主要依據(jù)是《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》[2]中的分光光度法，該方法是B類方法，經(jīng)過國內(nèi)的研究和多個單位的實驗驗證表明是成熟的統(tǒng)一方法，有待上升為國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法，但該方法未明確檢出限、精密度和準(zhǔn)確度等一系列方法特性指標(biāo)，本文以《國家環(huán)境污染物監(jiān)測方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則（HJ168-2010）》[3]為依據(jù)，通過試驗確立本方法的特性指標(biāo)，并結(jié)合日常工作經(jīng)驗提出本方法試驗過程中的注意事項和關(guān)鍵點，為國標(biāo)方法的建立以及分析人員的日常檢測工作提供參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：紫外-可見分光光度計、離心機、抽濾裝置、研缽、0.45 μm乙酸纖維濾膜。試劑：葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品（CAS NO：479-61-8）、90%丙酮溶液、碳酸鎂粉末。

1.2試驗方法

1.2.1過濾。在抽濾器上裝好乙酸纖維濾膜。倒入定量體積的水樣進行抽濾，抽濾時負壓不能過大（約為50 kPa）。水樣抽完后，繼續(xù)抽1～2 min，以減少濾膜上的水分，該過程需在避光條件下完成[4-5]。

1.2.2提取。將濾膜放入研缽中，加入少量碳酸鎂粉末及2~3 mL 90%丙酮，充分研磨，提取葉綠素a。用離心機（3 000~4 000 r/min）離心10 min（可根據(jù)樣品的濃度和濁度適當(dāng)延長離心時間），將上清液倒入10 mL容量瓶中，再加2~3 mL 90%丙酮，繼續(xù)研磨提取，離心10 min，并將上清液再轉(zhuǎn)入容量瓶中，重復(fù)1~2次，用90%丙酮定容為10 mL，搖勻。

1.2.3測定。取上清液于1 cm光程的比色皿，分別讀取750、663、645、630 nm波長的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度測定，對樣品吸光度進行校正。

2結(jié)果與分析

2.1檢出限

按照HJ168-2010[3]的規(guī)定，對葉綠素a濃度為0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品進行測定，計算7次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照下式計算方法檢出限：

MDL=t（n-1，0.99）×S

式中：MDL為檢出限；n為樣品的平行測定次數(shù)；t為自由度為n-1且置信度為99%時的t分布（單側(cè)）（n=7時，t=3.143）；S為n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)果表明，7次測定結(jié)果分別為0.455、0.408、0.437、0.361、0.417、0.434、0.424 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）為0.030，檢出限為0.094 mg/L。因此，葉綠素a的檢出限為0.094 mg/L，當(dāng)提取液定容體積為10 mL，水樣量為1 000 mL時，葉綠素a 的檢出限為0.94 mg/m3。

2.2準(zhǔn)確度

由于目前沒有葉綠素a的標(biāo)準(zhǔn)樣品，因此以加標(biāo)回收率考察方法的準(zhǔn)確性[6]。本試驗分別以空白加標(biāo)和實際樣品加標(biāo)對方法的準(zhǔn)確度進行考察，加標(biāo)方法為對實際樣品抽濾后，在研磨濾膜時加入葉綠素a標(biāo)液，按照樣品分析的全過程進行分析，空白加標(biāo)以純水代替實際樣品，其余操作過程與實際樣品相同，測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明：空白樣品的加標(biāo)回收率為83.8%~92.0%，實際樣品的加標(biāo)回收率為80.2%~87.0%，該方法的加標(biāo)回收率較低，主要是因為研磨過程中葉綠素a的損失較大，如何減少損失、提高樣品分析的準(zhǔn)確性將有待進一步研究。

2.3精密度

對不同濃度的實際樣品平行測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的精密度，測定結(jié)果見表2。從測定結(jié)果可以看出，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.87%~9.84%。

3結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，本方法的檢出限為0.094 mg/m3，空白加標(biāo)回收率為83.8%~92.0%，實際樣品加標(biāo)回收率為80.2%~87.0%，精密度為5.87%~9.84%。據(jù)此提出試驗過程中的注意事項和關(guān)鍵點：一是樣品過濾前需充分搖勻，以免產(chǎn)生誤差；二是使用的玻璃器皿和比色皿均應(yīng)清潔、干燥、無酸，不要用酸浸泡或洗滌；三是如波長750 nm處的吸光度大于0.005，應(yīng)將溶液再次（或多次）充分離心后測定吸光度，需要多次離心時，不可用原離心管繼續(xù)離心，需將溶液轉(zhuǎn)移至清潔干燥離心管中；四是因為葉綠素提取液對光敏感，故整個試驗過程要盡量在微弱的光照下進行。

4參考文獻

[1] 屠清英.湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范[M].2版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，1990：268-270.

[2] 國家環(huán)境保護總局.水和廢水監(jiān)側(cè)分析方法[M].4版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：670.

[3] HJ 168-2010環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則[S].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2010.

[4] 高岐，趙旭光，譚煜媚.分光光度法測定-超聲波提取植物韭菜中葉綠素含量的研究[J].食品工業(yè)科技，2007（8）：166-167.

[5] 湯燦輝，黃潔，肖美鳳，等.淺談用分光光度法測定蟲茶中葉綠素的含量[J].求醫(yī)問藥，2012，10（11）：873-874.

[6] 周靜，胡忠軍，李培培，等.基于葉綠素a測定的分光光度法與bbe法比較：以千島湖為例[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2013，34（2）：80-84.

摘要按照《國家環(huán)境污染物監(jiān)測方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則（HJ168-2010）》的規(guī)定，確立分光光度法測定水中葉綠素a的特性指標(biāo)，為本方法國家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。結(jié)果表明：方法的檢出限為0.094 mg/m3，精密度為5.87%~9.84%，空白加標(biāo)回收率為83.8%~92.0%，實際樣品加標(biāo)回收率為80.2%~87.0%。同時提出試驗過程中的注意事項和關(guān)鍵點。

關(guān)鍵詞分光光度法；葉綠素a；測定方法；特性指標(biāo)；注意事項

中圖分類號O657.31文獻標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739（2014）11-0238-01

ResearchonDeterminationofChlorophyllainWaterbySpectrophotometricMethod

LIU Chang

（Liaoning Environment Monitoring Center，Shenyang Liaoning 110161）

AbstractAccording to the Technical Guidelines for Development and Revision of National Environmental Monitoring Methods and Standards（HJ168-2010），characteristic factors of Chlorophyll a determinated by Spectrophotometric method was established which providing basis for the establishment of the national standard. The results were as follows：The detection limit and relative standard deviation were 0.094 mg/m3 and 5.87%~9.84%，respectively，and the blank standard addition recovery and the sample standard addition recovery were 83.8%~92.0% and 80.2%~87.0%，respectively.The points for attention and the key points were provided.

Key wordsspectrophotometric method；Chlorophyll a；detection method；characteristic factors；points for attention

葉綠素a是評價湖泊富營養(yǎng)化的重要參數(shù)[1]，我國尚無國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法，目前葉綠素a監(jiān)測的主要依據(jù)是《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》[2]中的分光光度法，該方法是B類方法，經(jīng)過國內(nèi)的研究和多個單位的實驗驗證表明是成熟的統(tǒng)一方法，有待上升為國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法，但該方法未明確檢出限、精密度和準(zhǔn)確度等一系列方法特性指標(biāo)，本文以《國家環(huán)境污染物監(jiān)測方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則（HJ168-2010）》[3]為依據(jù)，通過試驗確立本方法的特性指標(biāo)，并結(jié)合日常工作經(jīng)驗提出本方法試驗過程中的注意事項和關(guān)鍵點，為國標(biāo)方法的建立以及分析人員的日常檢測工作提供參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：紫外-可見分光光度計、離心機、抽濾裝置、研缽、0.45 μm乙酸纖維濾膜。試劑：葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品（CAS NO：479-61-8）、90%丙酮溶液、碳酸鎂粉末。

1.2試驗方法

1.2.1過濾。在抽濾器上裝好乙酸纖維濾膜。倒入定量體積的水樣進行抽濾，抽濾時負壓不能過大（約為50 kPa）。水樣抽完后，繼續(xù)抽1～2 min，以減少濾膜上的水分，該過程需在避光條件下完成[4-5]。

1.2.2提取。將濾膜放入研缽中，加入少量碳酸鎂粉末及2~3 mL 90%丙酮，充分研磨，提取葉綠素a。用離心機（3 000~4 000 r/min）離心10 min（可根據(jù)樣品的濃度和濁度適當(dāng)延長離心時間），將上清液倒入10 mL容量瓶中，再加2~3 mL 90%丙酮，繼續(xù)研磨提取，離心10 min，并將上清液再轉(zhuǎn)入容量瓶中，重復(fù)1~2次，用90%丙酮定容為10 mL，搖勻。

1.2.3測定。取上清液于1 cm光程的比色皿，分別讀取750、663、645、630 nm波長的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度測定，對樣品吸光度進行校正。

2結(jié)果與分析

2.1檢出限

按照HJ168-2010[3]的規(guī)定，對葉綠素a濃度為0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品進行測定，計算7次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照下式計算方法檢出限：

MDL=t（n-1，0.99）×S

式中：MDL為檢出限；n為樣品的平行測定次數(shù)；t為自由度為n-1且置信度為99%時的t分布（單側(cè)）（n=7時，t=3.143）；S為n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)果表明，7次測定結(jié)果分別為0.455、0.408、0.437、0.361、0.417、0.434、0.424 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）為0.030，檢出限為0.094 mg/L。因此，葉綠素a的檢出限為0.094 mg/L，當(dāng)提取液定容體積為10 mL，水樣量為1 000 mL時，葉綠素a 的檢出限為0.94 mg/m3。

2.2準(zhǔn)確度

由于目前沒有葉綠素a的標(biāo)準(zhǔn)樣品，因此以加標(biāo)回收率考察方法的準(zhǔn)確性[6]。本試驗分別以空白加標(biāo)和實際樣品加標(biāo)對方法的準(zhǔn)確度進行考察，加標(biāo)方法為對實際樣品抽濾后，在研磨濾膜時加入葉綠素a標(biāo)液，按照樣品分析的全過程進行分析，空白加標(biāo)以純水代替實際樣品，其余操作過程與實際樣品相同，測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明：空白樣品的加標(biāo)回收率為83.8%~92.0%，實際樣品的加標(biāo)回收率為80.2%~87.0%，該方法的加標(biāo)回收率較低，主要是因為研磨過程中葉綠素a的損失較大，如何減少損失、提高樣品分析的準(zhǔn)確性將有待進一步研究。

2.3精密度

對不同濃度的實際樣品平行測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的精密度，測定結(jié)果見表2。從測定結(jié)果可以看出，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.87%~9.84%。

3結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，本方法的檢出限為0.094 mg/m3，空白加標(biāo)回收率為83.8%~92.0%，實際樣品加標(biāo)回收率為80.2%~87.0%，精密度為5.87%~9.84%。據(jù)此提出試驗過程中的注意事項和關(guān)鍵點：一是樣品過濾前需充分搖勻，以免產(chǎn)生誤差；二是使用的玻璃器皿和比色皿均應(yīng)清潔、干燥、無酸，不要用酸浸泡或洗滌；三是如波長750 nm處的吸光度大于0.005，應(yīng)將溶液再次（或多次）充分離心后測定吸光度，需要多次離心時，不可用原離心管繼續(xù)離心，需將溶液轉(zhuǎn)移至清潔干燥離心管中；四是因為葉綠素提取液對光敏感，故整個試驗過程要盡量在微弱的光照下進行。

4參考文獻

[1] 屠清英.湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范[M].2版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，1990：268-270.

[2] 國家環(huán)境保護總局.水和廢水監(jiān)側(cè)分析方法[M].4版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：670.

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