轉Bt基因抗蟲棉的生物安全性研究進展

王立國　李菲　劉勤紅等

摘要：作為一種生物技術產品，轉Bt基因抗蟲棉的生物安全性一直是人們關注和爭論的焦點。世界上許多棉花主產國通過嚴格的試驗從基因漂移、靶標害蟲對Bt蛋白的抗性產生及治理對策、抗蟲棉種植對非靶標昆蟲及土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響以及轉Bt基因抗蟲棉產品的食品安全性等方面進行了大量研究。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有關生物安全方面的問題。由于對棉鈴蟲等鱗翅目害蟲的有效控制及其所產生的經濟和生態(tài)效益，轉Bt基因抗蟲棉已經為越來越多的人們所接受，對維持世界棉花的可持續(xù)發(fā)展產生了不可替代的作用。

關鍵詞：轉Bt基因抗蟲棉；生物安全；基因漂移；靶標昆蟲；土壤生態(tài)系統(tǒng)

中圖分類號：S562∶S336文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）07-0150-07

AbstractAs a biotech product， the biosafety of transgenic Bt cotton is always the focus of attention and controversy. The leading cotton producing countries in the world have conducted extensive researches from the aspects of gene flow， resistance of target insects to Bt protein and its countermeasures， the impacts of Bt cotton on non-target insects and soil ecosystem， as well as the food safety of Bt cotton products. So far， there was no potential hazard. As a result of its effective control of Lepidopteran insects and the economic and ecological benefits， the transgenic Bt cotton have been widely accepted，and it has been playing an irreplaceable role in maintaining the sustainable development of global cotton production.

Key wordsTransgenic Bt cotton； Biosafety； Gene flow； Target insects； Soil ecosystem

轉Bt基因抗蟲棉最早于1996年在美國獲準進行商業(yè)化生產，隨后澳大利亞、中國、墨西哥、南非、哥倫比亞、印度等國家開始引進和推廣。截至2009年，美國的轉基因棉花種植面積占總面積的88%，其中轉Bt基因抗蟲棉面積占65%以上。我國于1997年開始種植轉基因抗蟲棉，并迅速得到了大面積普及和推廣，截至2012年，Bt基因抗蟲棉在我國的栽培面積已達到棉花面積的75%以上。Bt基因抗蟲棉的種植有效控制了棉鈴蟲等鱗翅目害蟲的危害，大大降低了廣譜性殺蟲劑的應用，提高了棉花單位面積產量和效益，在棉花生產上發(fā)揮了重要作用。但是作為一種生物技術產品，Bt基因抗蟲棉對人類健康和環(huán)境可能有潛在的負面影響，在試驗研究的各個環(huán)節(jié)必須進行嚴格的審批和管理，并在釋放前進行轉基因生物安全性評價。近年來，國內外針對轉Bt基因抗蟲棉的安全性進行了大量研究，本文從Bt殺蟲蛋白對人類及動物的食品安全性、基因漂移、Bt蛋白對土壤生態(tài)系統(tǒng)及棉田非靶標害蟲的影響以及害蟲抗性治理策略等方面就近年來國內外的相關研究進行了綜述。

1Bt殺蟲蛋白對人類及動物的食品安全性

1.1Bt殺蟲蛋白對靶標害蟲的作用機理

目前已經進行商業(yè)化應用的轉Bt基因抗蟲棉所含外源殺蟲基因均來自蘇云金桿菌（Bacillus thurigiensis， Bt），主要包括殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins， ICPs）基因cry1Ac、cry1Ab、cry2Ab2以及營養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vegetative Insecticidal Proteins， VIP）基因Vip3A等，其中Cry1蛋白對鱗翅目害蟲有專一性；Cry2蛋白對鱗翅目和雙翅目害蟲有專一性；而VIP3A蛋白對棉鈴蟲、煙草夜蛾、紅鈴蟲等某些鱗翅目害蟲有專一性。Cry殺蟲晶體蛋白在pH 9.5以上的昆蟲堿性中腸液中溶解，在胰蛋白酶作用下，切除C-端，加工成有活性的毒蛋白，再與中腸上皮細胞刷狀緣膜囊泡（Brush Border Membrane Vesicles， BBMV）的受體結合，形成孔道，中腸細胞溶解破碎，導致死亡；而VIP3A毒蛋白在pH<7.5時即可溶解，直接與敏感昆蟲中腸上皮受體結合，誘發(fā)細胞核溶解、細胞凋亡，從而導致害蟲死亡[1]。由于兩類殺蟲蛋白的殺蟲機理不同，與之結合的受體不同，不存在交互抗性，同時使用時具有協(xié)同增效作用，能顯著提高殺蟲效力。

1.2Bt殺蟲蛋白對人類及動物的食品安全性

棉籽具有較高的賴氨酸含量，是一種重要的植物蛋白，常加工成食品或動物飼料。棉籽油是世界第六大植物油來源，通常作為烹調、煎炸用油或沙拉汁而廣泛使用。因此轉基因抗蟲棉Bt殺蟲蛋白對人類和動物的食品安全性備受關注。在轉基因抗蟲棉品種釋放之前，通常對Bt殺蟲蛋白進行氨基酸序列同源性比對、動物飼喂試驗、體外消化分析及口服毒性測試等毒理檢測來評價其安全性。

來自共同祖先的同源蛋白具有相似的氨基酸序列，通常具有結構和功能相似性。因此將殺蟲蛋白與目前已知的人和動物的毒性蛋白質進行氨基酸序列相似性比較，可以發(fā)現(xiàn)殺蟲蛋白對人類和動物的潛在毒性。通過將Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab2及Vip3A的氨基酸序列與PIR、EMBL、SwissProt及GenBank蛋白質數(shù)據庫比對，均未發(fā)現(xiàn)其與已知毒蛋白具有序列相似性。另外將這些殺蟲蛋白與過敏原蛋白氨基酸序列進行比對，也未發(fā)現(xiàn)序列相似性，因此認為Bt殺蟲蛋白不具有已知過敏原的特性，即不存在潛在過敏性。

事實上早在轉基因抗蟲棉釋放之前，在全球范圍內Bt殺蟲劑已在多種作物上得到了廣泛應用，對控制鱗翅目害蟲發(fā)揮了重要作用，沒有對人類健康和環(huán)境產生不利影響[2]。人類或動物腸道為酸性環(huán)境，pH值約1.5，且缺乏可與Bt殺蟲蛋白結合的受體[3～5]，因此Bt殺蟲蛋白難以在人類及動物中發(fā)揮毒性效應。

Betz 等（2006）[6]以4 200 mg/kg體重的高劑量Cry1Ac蛋白飼喂小鼠，結果未顯示出急性口服毒性效應；分別用Cry1Ac、Cry2Ab蛋白對蜜蜂、草蛉幼蟲、寄生蜂、瓢蟲、彈尾蟲、蚯蚓、鵪鶉和小鼠等進行試驗，在超過預期環(huán)境濃度10～100倍的劑量下，受試物種的生長發(fā)育均未發(fā)現(xiàn)明顯不利效應。Castillo等（2001）[7]分別用含轉基因和非轉基因棉籽成分的飼料飼喂小鼠、河鯰、奶牛，在體重增長、生存能力、健康狀況及產奶量等方面二者之間無顯著差異。孟山都公司分別用含Cry1Ac蛋白500、1 000、4 300 mg/kg 體重的飼料飼喂大鼠、小鼠、家兔、羊等，均未發(fā)現(xiàn)明顯的急性毒性效應，這些動物在體重、食物消耗及其它方面與對照無明顯差異。先正達公司以1 450 mg/kg體重的Cry2Ab2蛋白飼喂小鼠，也未發(fā)現(xiàn)有毒性效應；用大劑量的Cry1Ab蛋白對地上節(jié)肢動物花蝽與瓢蟲、地下節(jié)肢動物隱翅蟲與彈尾蟲、傳粉動物蜜蜂、鳥類鵪鶉、哺乳動物老鼠、水生無脊椎動物水蚤、魚類鯰魚等進行試驗，也均未發(fā)現(xiàn)對受試生物產生明顯不利影響。

在印度，利用Bt棉籽飼料飼喂山羊、水牛、奶牛、家兔、鳥和魚，結果均顯示沒有副作用，與對照試驗動物無顯著差異。陳松等用含抗蟲棉棉籽的飼料飼喂小鼠、大鼠、鵪鶉和鯉魚等，與對照相比均未發(fā)現(xiàn)明顯差異，但長期飼養(yǎng)是否有慢毒性或對后代是否有影響還需進一步研究[8，9]。

由于棉花花粉粒大且有粘性，不會隨風進行長距離擴散，接觸到水生生物的可能性極小。種子和植物殘渣也不易通過陸地徑流或風擴散到水生群落。據此，美國國家環(huán)境保護署（EPA）認為：在遵循轉基因生物標識制度的前提下，Cry蛋白對非靶標生物如鳥類、淡水魚類、淡水無脊椎動物類、近海和深海動物、節(jié)肢動物捕食類/擬寄生類、蜜蜂、環(huán)節(jié)動物類以及野生哺乳動物等的毒性和傳染性風險極小甚至是不存在的。

2基因漂移

2.1Bt基因向棉花近緣植物的轉移

基因漂移是指一種生物的目標基因向附近野生近緣種的自發(fā)轉移，使后者具有目標基因的一些優(yōu)勢特征，可導致整個生態(tài)環(huán)境發(fā)生結構性的變化。Bt基因自轉基因植株向近緣植物和雜草的潛在轉移問題是人們關注的焦點。

棉花的近緣雜草植物極少，主要有陸地棉野生種、夏威夷棉（Gossypium tomentosum）、瑟伯氏棉（Gossypium thurberi）和Gossypium comstocksii等。陸地棉起源于中美洲墨西哥一帶，遍布于加勒比海、南美洲北部及一些太平洋群島上。根據形態(tài)和地理分布，主要有7個陸地棉野生種系：尤卡坦棉（Yucatanense）、尖班棉（Punctatum）、闊葉棉（Latifolium）、馬麗加朗特棉（Marie-Galante）、鮑莫爾氏棉（Paimeri）、莫利爾氏棉（Morrilli）和李奇蒙德氏棉（Richmondii）。陸地棉野生種屬瀕危物種，為了保護生物多樣性，美國在陸地棉野生種存在區(qū)域如佛羅里達州中南部嚴禁種植轉基因抗蟲棉，以防止抗蟲棉同野生陸地棉進行天然雜交。

夏威夷棉是一種稀有植物，僅存于美國夏威夷群島，沒有雜草化傾向或侵害特性。盡管在實驗室和溫室控制條件下，夏威夷棉可以同陸地棉雜交并產生可育后代，但通過分子標記分析未找到陸地棉基因在自然條件下向夏威夷棉轉移的證據[10]。作為一種預防措施，美國環(huán)境保護署禁止Bt棉在夏威夷進行商業(yè)化利用。瑟伯氏棉不是瀕危物種，存在于美國南亞利桑那山區(qū)，由于其僅含D染色體組，與陸地棉雜交不親和，因此不可能發(fā)生天然異交。Gossypium comstocksii僅發(fā)現(xiàn)于印度古吉拉特邦北部非棉花種植區(qū)。另外，廣泛分布于亞洲和非洲等地區(qū)的亞洲棉和草棉，均為二倍體A染色體組，也不能與陸地棉發(fā)生天然雜交。

因此，由于雜交不親和性、花期不遇或地理隔離等原因，Bt基因自轉基因抗蟲棉向陸地棉野生種或近緣植物發(fā)生基因漂流或基因漸滲的可能性是基本上不存在的。

2.2Bt基因向土壤微生物的橫向轉移

橫向基因轉移（Horizontal gene transfer）是指DNA自一個物種向另一個物種的轉移。在自然條件下蘇云金芽孢桿菌的各亞種或菌系存在于土壤中，各種cry基因有可能通過轉化、接合或轉導等途徑由蘇云金芽孢桿菌向其它土壤微生物進行橫向轉移。然而沒有證據顯示從植物到微生物的橫向基因轉移或DNA表達[11]，即使有，也非常罕見[12]。與植物密切相關的細菌如農桿菌和根瘤菌基因組已被測序，其序列中不包含來自植物的基因。在基因構建過程中，啟動子和編碼序列已經被優(yōu)化用于植物表達，而非細菌表達。

因此，在轉Bt基因抗蟲棉種植過程中，即使通過同源重組（Homologous Recombination）、異常重組（Illegitimate Recombination）、位點特異性重組（Site-specific Recombination）及質粒重建（Reconstitution of Plasmids）等途徑發(fā)生由棉株向微生物的橫向基因轉移，在細菌中也不可能產生轉基因相應的蛋白質，不會對原核生物的進化發(fā)生影響，也不會對人類或動物及環(huán)境產生不良影響[12]。事實上，對抗生素選擇標記基因的研究表明，在實驗室或大田條件下，均未發(fā)現(xiàn)標記基因由植物向細菌橫向轉移的證據，也未發(fā)現(xiàn)抗生素選擇標記基因從植物向人類、反芻動物或其它動物的腸道菌群中橫向轉移的證據[13]。

2.3Bt基因向非轉基因棉田的擴散

由于棉花為常異花授粉作物，天然雜交以昆蟲傳粉為主，異交率一般在3%～8%，高的可達15%以上。研究顯示，在花粉源為1米的范圍內，大部分棉田異交率低于10%。因此通過種植邊行、設置隔離帶或自然屏障等措施，可以有效防止Bt外源基因向非轉基因棉田擴散。在隔離距離上，研究者的結論不盡一致，多數(shù)認為一般在30～100 m[14]。另外，世界各國在有機棉、優(yōu)質專用棉和彩色棉的生產中，通常要求進行農場隔離、物理隔離或設置緩沖帶；在種植、收獲、運輸、儲存、清理及軋花等環(huán)節(jié)嚴防種子人為機械混雜。

3轉基因抗蟲棉對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響

3.1Bt殺蟲蛋白在土壤中的活性

Bt殺蟲蛋白在轉基因抗蟲棉根、莖、葉等主要器官中均存在，由抗蟲棉的根系、殘渣或花粉滲出的殺蟲晶體蛋白，均可進入土壤中并在一定時間內保持活性[15，16]。然而，蛋白質的基本生物學特性決定了其一旦被分泌至土壤環(huán)境中，極易被微生物或非生物途徑降解[17]。研究人員通過試驗確定了土壤中殺蟲蛋白的數(shù)量和持續(xù)性，認為Bt殺蟲蛋白不可能在土壤中累積從而產生延遲效應，更不可能通過食物鏈進行累積。然而，分泌至土壤中的Bt毒素一旦與土壤粘粒結合則難以降解，其活性持續(xù)時間與粘粒含量呈正比，而與土壤pH值呈反比[18]。中性土壤中Bt毒蛋白的活性降低較快[19]。有研究認為與粘粒結合的殺蟲蛋白自土壤中洗脫后將迅速被微生物降解[20]。一些研究在抗蟲棉根際未能檢出Bt毒蛋白[21，22]，也證實了Bt毒蛋白在土壤環(huán)境中的快速降解特性。

3.2Bt殺蟲蛋白對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響

土壤微生物多樣性對土壤生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能有著重要作用。由于土壤微生物對環(huán)境變化極為敏感，很有可能會受到土壤中有活性的Bt毒蛋白的影響。孟山都公司研究了Bt棉株瀝出液對土壤根際和非根際微生物菌群的影響，結果顯示與對照無顯著差異。一些研究也發(fā)現(xiàn)土壤微生物多樣性及其活性在Bt玉米田和Bt棉田中與非轉基因的對照大田沒有顯著差異[23，24]。但也有抗蟲棉對土壤微生物數(shù)量或根際微生物環(huán)境產生顯著影響的報道，認為造成土壤中微生物數(shù)量、組成與種類的差異不是Bt毒素本身引起的，而是由轉基因植株的生理生化特性或表達產物的化學和生物學特性引起的[25]。

4抗蟲棉種植對棉田非靶標生物的影響

4.1對非靶標害蟲的影響

自從20世紀90年代中期，大量研究顯示轉Bt基因抗蟲棉的種植對棉田非靶標害蟲沒有直接的影響[2，6，26～29]，對非靶標害蟲的多樣性也無顯著不利影響[27～33]，反而由于減少了化學殺蟲劑的應用，使棉田生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性有所增加[27，28，32]。然而一些研究認為轉Bt基因抗蟲棉可以通過對鱗翅目害蟲的抑制對棉田生態(tài)系統(tǒng)中的非鱗翅目害蟲產生間接影響。例如通過對鱗翅目害蟲的影響而間接促進甘薯白粉虱的種群增長[34]，使棉蚜、棉葉螨、棉盲蝽、白粉虱和棉葉蟬等刺吸性害蟲[36]以及斜紋夜蛾、甜菜夜蛾[37]的為害加重，加快了棉田紅蜘蛛種群的發(fā)展速度等[37]。同常規(guī)棉田廣譜性殺蟲劑的使用相比較，轉Bt基因抗蟲棉的種植對非靶標生物的有害性大大降低[29，32，38]。

4.2對天敵的影響

國外大量的大田及實驗室研究表明，表達Bt蛋白的轉基因玉米、棉花對捕食性天敵無直接不利影響[29，33，39]。王武剛等[38]也調查發(fā)現(xiàn)轉Bt基因棉對棉田自然天敵影響不顯著。夏敬源等[41]在大田試驗中發(fā)現(xiàn)轉Bt基因抗蟲棉田棉鈴蟲的捕食性天敵的數(shù)量減少不明顯。Naranjo[33]在亞利桑那研究發(fā)現(xiàn)Bt棉對節(jié)肢動物天敵、蟻類和甲蟲的數(shù)量和功能影響極小。吳孔明等[42]的調查結果則表明抗蟲棉田瓢蟲類、草蛉類和蜘蛛類捕食性天敵的數(shù)量與常規(guī)棉田相比大幅度增加。Jenkins[43]報道轉Bt基因棉能間接提高天敵的捕食率[42]。由于棉鈴蟲等鱗翅目靶標害蟲的減少，種植轉Bt基因棉對寄生性天敵的間接影響相對較大，嚴重影響棉鈴蟲幼蟲優(yōu)勢寄生性天敵的數(shù)量、寄生率、羽化率和捕食量[40，43]。

5害蟲抗性治理策略

5.1害蟲對Bt蛋白的抗性

連續(xù)種植Bt作物有可能導致害蟲對殺蟲蛋白產生抗性，從而使轉基因作物喪失應用價值。目前，實驗室和大田研究均已檢測到害蟲抗性的產生。梁革梅等[45]在實驗室內對棉鈴蟲抗毒蛋白品系經過100多代篩選，抗性倍數(shù)達3 000多倍，研究發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲對CrylAc蛋白的抗性是由單個不完全隱性基因控制的。Tabashnik等[46]的研究也表明棉鈴蟲對轉Bt基因棉的抗性是常染色體控制的不完全隱性遺傳。Meng等[47]用Bt棉葉連續(xù)對棉鈴蟲篩選50多代，對Cry1Ac蛋白的抗性達1 600倍以上， 也認為其抗性基因為單個主效基因的不完全隱性遺傳。而且棉鈴蟲對Bt農藥和轉Bt棉品系間存在交互抗性[48]。在大田研究中發(fā)現(xiàn)在美國東南部Bt棉連續(xù)種植7～8年后，棉鈴蟲對Cry1Ac蛋白產生抗性，可能原因是Bt毒蛋白表達量沒有達到高劑量水平[49]。劉鳳沂等[50]用F1代法檢測到田間棉鈴蟲對轉Bt基因棉的高抗性等位基因頻率。張洋等[51]研究表明，我國黃河流域棉區(qū)田間棉鈴蟲種群對Cry1Ac毒素尚未產生明顯抗性，但對毒素的耐受性有升高趨勢。

害蟲對Bt殺蟲蛋白的抗性機制目前還不十分清楚，有研究認為同殺蟲蛋白與中腸細胞上受體蛋白結合能力的改變有關[51]；或者是由于昆蟲中腸內pH值和酶的變化影響了殺蟲蛋白晶體的溶解和活力[52，53]；也有人認為與抗性品系修復受損細胞的能力較強有關。

5.2害蟲抗性治理策略

通過多基因策略或庇護所策略可以阻止或延緩害蟲對毒蛋白產生抗性。多基因策略是指利用基因工程手段將幾種Bt殺蟲蛋白基因導入同一作物中。孟山都公司的BollgardⅡ棉花同時含有cry1Ac和cry2Ab2兩種Bt基因，先正達公司的VipCotTM棉花則含有Vip3A和FLcry1Ab兩種Bt基因。由于不同的毒蛋白具有不同的結合位點，不但提高了殺蟲活性，擴大了殺蟲譜，也使得害蟲同時對兩種蛋白產生抗性的幾率大為降低。但只有害蟲對兩個基因無交互抗性，多基因策略才能發(fā)揮作用。

庇護所策略是指在Bt棉田周圍種植20%的非Bt棉或其它寄主作物，并對其進行常規(guī)害蟲防治，或者種植5%的非抗蟲棉，不對其進行害蟲防治。因為絕大部分在Bt作物中存活的抗性害蟲將會與庇護所中產生的敏感害蟲交配，若抗性為隱性遺傳，則雜交后代在Bt作物中將會死亡，大大減慢了抗性的進化。盡管有室內研究發(fā)現(xiàn)由于發(fā)育時期的差異一些害蟲的抗感種群的成蟲不能隨機交配，害蟲抗性為不完全或非隱性遺傳等[55，56]。Tabashnik等[49]通過對Bt玉米和棉田中6種主要鱗翅目害蟲十余年抗性檢測的數(shù)據分析表明，庇護所策略可以在大田中推廣應用。目前庇護所策略作為一種害蟲抗性管理措施已經在美國、印度、澳大利亞等國家推行。

假如Bt植株上害蟲進食的毒蛋白劑量足夠高，則幾乎所有雜交后代將被殺死[57]，因此這種方法又稱作“高劑量庇護所策略”。大量的研究認為在沒有庇護所的情況下，害蟲對毒蛋白的抗性進展很快，而庇護所可以延緩甚至阻止抗性的發(fā)生[58，59]。肖留斌等[60]在人工模擬“庇護所”和“非庇護所”條件下探討了棉鈴蟲對Bt棉的抗性演變規(guī)律，發(fā)現(xiàn)與雜交棉鈴蟲品系相比，自交品系能更快地對Bt棉產生適應性，Bt棉對自交品系棉鈴蟲的抗性也易于下降，據此認為利用庇護所策略延緩棉鈴蟲對轉Bt基因棉的抗性產生是可行的。由于我國抗蟲棉種植區(qū)域主要集中在黃河、長江流域棉區(qū)，棉田面積小而分散，通常以棉鈴蟲的其它寄主作物如大豆、花生和玉米等作為天然庇護所。

6結語

轉基因植物對生態(tài)環(huán)境、人類健康、非靶標生物的潛在影響，靶標生物的抗性進化，以及外源基因向野生種群及土壤微生物轉移的可能性等是生物安全研究的重要內容，已經引起政府和社會各界的廣泛關注。為此，世界各國制定了相應的政策、法規(guī)或條例來確保在轉基因植物釋放前對其安全性進行公正合理的評價，同時在實驗室研究、中間試驗、環(huán)境釋放、生產性試驗和越境轉移等各個環(huán)節(jié)進行嚴格的審批和管理。

轉Bt基因抗蟲棉是全球范圍內最早進行商業(yè)化種植的轉基因作物之一，在世界主產棉國家中國、美國、印度等均得到了迅猛發(fā)展。近年來，國內外通過大量田間試驗和實驗室研究進行了各種風險的評估，基本上證實了其對環(huán)境、人類、動物及農業(yè)的安全性。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)任何生物安全或害蟲抗性等方面的事件。

然而，目前尚有一些問題存在爭議，比如轉Bt基因抗蟲棉的種植可能導致棉田生物種群的變化等。多數(shù)研究的試驗年限較短，不能評價外源轉基因對生態(tài)環(huán)境或人類健康的長期潛在影響。因此，必須進一步規(guī)范安全評價的試驗技術與方法，對轉Bt基因抗蟲棉的生態(tài)風險及食品安全性進行長期跟蹤監(jiān)測研究，建立與抗蟲棉生產相配套的病蟲害可持續(xù)治理策略，為轉Bt基因抗蟲棉的持續(xù)利用提供更加科學合理的依據。

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