牛奶中青霉素G及青霉噻唑酸的UPLC－MS／MS法測定

劉 靜，鄭增忍，趙思俊，曲志娜，王君瑋，孫曉亮，譚維泉，劉 坤，曹旭敏，鄒 明

（1.青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島266109；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島266032）

青霉素G（penicillin G）屬于β－內(nèi)酰胺類抗生素，價格低廉，療效顯著，常用于治療奶牛乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎等常見奶牛疾病。然而藥物的不合理使用會在牛奶中造成殘留，青霉素G化學結(jié)構(gòu)中的β－內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定，容易發(fā)生酶解，產(chǎn)生以青霉噻唑酸為主的代謝產(chǎn)物。牛奶中殘留的青霉素G或青霉噻唑酸會成為青霉素過敏患者的過敏原，引起患者的過敏反應，甚至造成過敏性休克危及患者生命安全［1］。為保護消費者的安全，食品法典委員會、歐盟、美國和我國農(nóng)業(yè)部等均對牛奶中青霉素G的最高殘留限量（maximum residue limits，MRLs）為4μg／kg，青霉噻唑酸的 MRLs尚未規(guī)定［2］。建立青霉素G及代謝產(chǎn)物快速而靈敏的檢測方法，對保護消費者安全具有重要意義。

動物性食品中β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測方法已有報道［3－5］，但同時對青霉素G和青霉噻唑酸進行研究的報道較少。Kress C等［6］研究了酶聯(lián)免疫吸附試驗測定羊奶中的青霉噻唑酸，該方法適用于樣品的大量篩選，不適用于確證檢測。陳聰?shù)龋?］研究了測定血漿中青霉素G及代謝物的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，研究了青霉素G及代謝產(chǎn)物的消除規(guī)律。劉創(chuàng)基等［8］研究了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛肉中青霉素類藥物及代謝產(chǎn)物殘留的方法，采用乙腈勻漿提取，正己烷去脂的方法，樣品處理過程復雜。馮月超等［9］建立了牛奶中青霉素G和青霉噻唑酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，藥物回收率為92%～103%，青霉素G的定量限5 μg／kg，超過了國家對牛奶中青霉素 G的規(guī)定MRLs，且該方法未消除牛奶基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。本試驗在此基礎(chǔ)上采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS／MS）對牛奶中青霉素G及青霉噻唑酸同時進行測定，優(yōu)化樣品的前處理方法，對基質(zhì)效應的影響進行研究和消除，為快速準確的檢測該類藥物提供可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主 要 儀 器 設 備 AcquityTMUPLC－Xevo TQMS超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀、Oasis HLB固相萃取柱，美國 Waters公司產(chǎn)品；N2蒸發(fā)儀，美國Organomation Associates公司產(chǎn)品；QL－866型漩渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；J2－21型高速冷凍離心機，美國Backman公司產(chǎn)品；HY－5型回旋振蕩器，常州國華電器有限公司產(chǎn)品；Q－純水儀，美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 青霉素 G（penicillin G，純度99.5%），德國 Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；青霉噻唑酸（benzylpenicillin acid純度98.6%），英國LGC公司產(chǎn)品；甲醇、甲酸、乙腈（色譜純），德國 Merck公司產(chǎn)品；高純水（Millipore，17.9MΩ·cm）、乙醇、甲酸銨（分析純），國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 標準儲備液的配置，即準確稱取青霉素G及青霉噻唑酸標準品到10mL棕色容量瓶中，分別用500mL／L乙腈水溶解并定容，配成1 000μg／mL的標準儲備液，置－20℃冷藏保存。臨用前用500mL／L乙腈水稀釋至工作濃度標準溶液。

1.2.2 UPLC－MS／MS條件

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為 Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100mm ×2.1mm，1.7μm ），流動相A為1mL／L甲酸溶液，B為乙腈溶液，進樣量5μL，柱溫35℃，流速0.3mL／min，梯度洗脫程序如表1所示。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI＋），正離子掃描，多反應監(jiān)測（MRM）模式，毛細管電壓：2.5kV；離子源溫度150℃，霧化器流1 000L／h，錐孔氣流50L／h，霧化室溫度500℃（表2）。

表1 分離青霉素G及青霉噻唑酸的梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution of penicillin G and benzylpenicillin acid

表2 青霉素G及其青霉噻唑酸的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 2 The mass spectrum detection parameters of penicillin G and benzylpenicillin acid

1.2.3 牛奶樣品的前處理

1.2.3.1 提取 取空白牛奶加標樣品2mL于50mL離心管中，加入6mL乙腈∶乙醇（3∶1，V∶V）的混合溶液，渦旋混勻，振蕩提取20min，以10 000r／min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移潔凈試管內(nèi)，50℃ 下 N2吹干，用3mL 0.01mol／L 甲酸銨（pH8.5）溶解，待用。

1.2.3.2 凈化 將溶液加入到用3mL甲醇活化，3mL水和3mL 0.01mol／L甲酸銨（pH8.5）平衡的HLB固相萃取柱中，依次用2mL 0.01mol／L甲酸銨（pH8.5）和1mL水淋洗，抽干，經(jīng)3mL乙腈洗脫后，收集洗脫液，50℃下N2吹干。殘余物用1mL 200mL／L乙腈水復溶，過0.2μm濾膜，供 UPLCMS／MS測定。

1.2.4 標準曲線的繪制

1.2.4.1 標準品直接稀釋 用200mL／L乙腈水稀釋標準品，制備系列標準溶液，進行UPLC－MS／MS分析，以定量離子的峰面積為縱坐標（y），標準品添加濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線，并求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4.2 基質(zhì)添加校正曲線 取2mL空白牛奶于50mL離心管中，按照1.2.3方法進行處理，用200 mL／L乙腈水復溶后稀釋標準品，制備系列標準溶液，進行UPLC－MS／MS分析，以定量離子的峰面積為縱坐標（y），標準品添加濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線，并求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.5 基質(zhì)效應的測定 本研究按照Matuszewski B K等［10］提出的方法評價基質(zhì)效應的大小。青霉素G及青霉噻唑酸標準品用200mL／L乙腈水直接稀釋后測得的峰面積為S1?？瞻着Ｄ贪凑?.2.3方法處理，用200mL／L乙腈水復溶后稀釋標準品，測得的峰面積為S2，則基質(zhì)效應ME%＝S2／S1×100%。本試驗選取5、10、20、50、100μg／kg等濃度對基質(zhì)效應進行測定。

1.2.6 基質(zhì)效應的消除 按照1.2.4.2方法制備基質(zhì)添加校正曲線，并求出回歸方程，對試驗檢測樣品的檢測結(jié)果進行校正。

1.2.7 穩(wěn)定性研究 取空白牛奶按照1.2.3方法處理，200mL／L乙腈水復溶，青霉素G和青霉噻唑酸添加4μg／kg標準品（青霉噻唑酸MRL未規(guī)定，添加濃度同青霉素G），做6個平行，置于4℃和室溫（20℃～25℃）環(huán)境下0、24、48h后，進行檢測。

1.2.8 實際樣品測定 購買市場上的20份牛奶按照1.2.3方法處理，用200mL／L乙腈水復溶，過膜后上機檢測，對樣品中的青霉素G和青霉噻唑酸的含量進行測定。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍與檢測限

空白牛奶按照1.2.3方法處理，用200mL／L乙腈水復溶后稀釋標準品，制備系列標準工作溶液，定量離子的峰面積為縱坐標（y），標準品添加濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性良好。

空白牛奶添加不同濃度的標準品，渦旋混勻，室溫放置10min，按照1.2.3方法進行處理，UPLC－MS／MS測定，信噪比為3h和10h對應的濃度分別為檢測限和定量限（表3）。本方法靈敏度高、線性良好、能夠滿足食品中獸藥殘留分析的要求。

表3 方法的線性范圍和檢測限Table 3 Linearity range and detection limits for penicillin G and benzylpenicillin acid

2.2 基質(zhì)效應的大小

本研究按照Matuszewski B K等［10］提出的方法評價基質(zhì)效應的大小。當ME＝100%時，表明不存在基質(zhì)效應；當ME＞100%時，表明樣品基質(zhì)對分析物的檢測結(jié)果有增強作用；當 ME＜100%時，表明樣品基質(zhì)對分析物的檢測結(jié)果有抑制作用。實驗結(jié)果顯示在檢測范圍內(nèi)，青霉素G和青霉噻唑酸的ME分別為91.02%～96.08%、91.93%～97.67%，表明基質(zhì)對青霉素G和青霉噻唑酸存在不同程度的抑制作用，相同添加濃度下對青霉素G的抑制作用稍強于青霉噻唑酸，且藥物濃度越低，基質(zhì)效應的影響越大（圖1）。生物組織中藥物的殘留濃度一般較低，多為痕量檢測，因此在檢測過程中需要考慮基質(zhì)效應對結(jié)果的影響。

圖1 基質(zhì)效應結(jié)果Fig.1 Matrix effect results

2.3 方法的回收率和精密度

用空白牛奶樣品在低、中、高3個水平進行加標回收和精密度試驗，樣品添加不同濃度的標準溶液，渦旋混勻，靜置10min，按照1.2.3進行處理，UPLC－MS／MS進行檢測，基質(zhì)添加曲線進行校正，其回收率和精密度結(jié)果見表4。樣品的加標回收率為75.88%～106.01%，變異系數(shù)為6.65%～14.17%，符合獸藥殘留分析的要求。

2.4 穩(wěn)定性研究

以初次檢測的平均色譜峰面積為標準，計算不同溫度下間隔一定時間后的藥物含量回收率。試驗結(jié)果顯示，在4℃環(huán)境中，間隔24h和48h后青霉素G的回收率分別為96.97%和90.31%，青霉噻唑酸的回收率分別為91.63%和84.69%。在室溫條件下，青霉素G的回收率分別為88.76%和86.98%，青霉噻唑酸的回收率分別為84.12%和85.51%。結(jié)果表明兩種化合物均會隨放置時間的增長而發(fā)生降解，且室溫條件下降解速度較快，所以樣品處理后的保存需要考慮溫度的影響?，F(xiàn)實中經(jīng)常遇到不能立即檢測現(xiàn)象，本方法的靈敏度低，MRL濃度的樣品處理后，4℃保存48h，仍在本方法檢測范圍之內(nèi)，可提供一定程度的靈活性，但試驗結(jié)果的檢測濃度會受到一定影響，所以樣品處理后應盡快檢測，獲得最準確可靠的結(jié)果。

表4 方法的加標回收率和精密度Table 4 Recoveries and RSDs for penicillin G and benzylpenicillin acid

2.5 實際樣品測定

本試驗方法對購買的20份牛奶樣品進行檢測，檢測結(jié)果顯示。所購牛奶中均不含青霉素G及青霉噻唑酸殘留。

3 討論

3.1 UPLC－MS／MS的優(yōu)化

用200mL／L乙腈水分別配制濃度為1μg／mL的青霉素G和青霉噻唑酸標準溶液。在電噴霧正離子模式（ESI＋）下進行全掃描，觀察MSTune界面的［M＋H］＋峰的響應強度，選擇豐度較大的分子離子峰作為母離子，然后對其進行子離子掃描（Daughter Scan），獲得碎片離子峰，從中選擇響應較強的一對離子，其中較高的作為定性離子。對其質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化后，獲得的質(zhì)譜條件見表2。

在色譜分析中，流動相中的有機相多選擇甲醇或乙腈［5，7－8］，但甲醇含有羥基，可能與青霉素類藥物發(fā)生醇解，故本試驗選擇乙腈為有機相。采用正離子模式進行質(zhì)譜檢測時，流動相中添加甲酸有助于分析物的質(zhì)子化，而pH太低，則可能對藥物的保留和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。故本試驗參考相關(guān)文獻［8－9，14］，流動相選用1mL／L甲酸水和乙腈，梯度洗脫進行分離，色譜條件見表1。圖2為最優(yōu)條件下青霉素G和青霉噻唑酸標準品10μg／kg的色譜圖。圖中可以看出優(yōu)化條件后，目標物質(zhì)質(zhì)譜響應高，峰形理想，達到試驗檢測的要求。

3.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

牛奶樣品前處理通常會有除蛋白及除脂肪兩個關(guān)鍵步驟，提取青霉素類藥物的常用提取溶劑有乙腈［11］、酸化乙腈、乙醇等［11－13］，個別文獻采用無機溶劑如乙酸鋅－亞鐵氰化鉀，乙酸鉛－草酸鉀－磷酸氫二鈉等［14］，由于β－內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定，可能會使目標化合物分解。因此本試驗選擇了乙腈、乙醇及不同比例（V∶V，3∶1，1∶1）的乙腈－乙醇混合溶液進行試驗，試驗結(jié)果顯示相同的用量時，乙醇和乙腈－乙醇（V∶V，1∶1）的沉淀效果不理想，相同用量條件下，乙腈－乙醇（3∶1，V∶V）混合溶液可以獲得理想的沉淀效果和回收效率，且減少了乙腈的用量，所以本試驗選用乙腈－乙醇（3∶1，V∶V）混合溶液作為提取液。

參考有關(guān)文獻［8，12］對青霉素G和青霉噻唑酸的處理方法中，多采用提取液沉淀蛋白，冷凍高速離心去除脂肪的方法。Liu C J等［13］建立牛奶中青霉素及代謝產(chǎn)物的UPLC－MS／MS檢測法，牛奶離心后選用乙醇進行提取，離心后上清液旋轉(zhuǎn)蒸干，添加氯化鈉防止爆沸，乙酸銨溶解后再次進行高速離心，上清液過膜后進行檢測。由于Acquity UPLC色譜柱的填料粒徑小、柱體積小、柱壓高，所以對樣品的凈化效果也有更高的要求，上述試驗方法中使用氯化鈉，可能隨樣品溶液進入色譜柱，對色譜柱的正常使用造成影響，且該方法樣品的處理過程復雜。相關(guān)文獻［14－15］中，Oasis HLB 柱常被用于β－內(nèi)酰胺類藥物提取液的凈化，在樣品上樣前用pH8.5的0.05 mol／L磷酸緩沖液對Oasis HLB進行平衡。本試驗用Oasis HLB柱對提取溶液進行凈化，用甲酸銨代替磷酸鹽對Oasis HLB柱進行平衡，對甲酸銨的濃度和pH進行優(yōu)化篩選，試驗結(jié)果顯示甲酸銨溶液的濃度為0.01mol／L，pH8.5時，青霉素 G 和青霉噻唑酸的回收率高于75.88%，滿足試驗要求。甲酸銨為揮發(fā)性鹽，不存在堵塞色譜柱的問題，避免了影響儀器正常使用的風險。因此本試驗采用乙腈－乙醇混合溶液（V∶V，3∶1）提取牛奶中的青霉素G和青霉噻唑酸后，選用Oasis HLB進行凈化，提取凈化步驟簡單，藥物回收率達到75.88%～106.01%，試驗結(jié)果理想。

3.3 基質(zhì)效應的消除

牛奶基質(zhì)成分復雜，選用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，尤其是電噴霧離子源用來分析殘留藥物，往往會發(fā)生干擾物質(zhì)產(chǎn)生離子增強或者抑制的現(xiàn)象，故在方法驗證階段必須進行基質(zhì)效應的考察。內(nèi)標法和基質(zhì)校正添加曲線法定量，都能極大的消除基質(zhì)效應的影響，在消除基質(zhì)效應的研究中都有較多應用［15－17］，但內(nèi)標法需要使用內(nèi)標化合物，最好是氘代標記化合物，氘代標記化合物價格昂貴，難以獲取。因此，本研究選用基質(zhì)添加校正曲線法消除基質(zhì)效應，進行定量。此方法操作簡單，節(jié)約成本，且試驗結(jié)果穩(wěn)定，校正后樣品加標回收率為75.88%～106.01%，變異系數(shù)為6.65%～14.17%，試驗結(jié)果的重復性與精密度較為理想，滿足試驗要求。

本研究采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS／MS），通過對樣品提取、凈化等條件的優(yōu)化，選用基質(zhì)校正添加曲線法進行定量，建立了一種簡單、快速的青霉素G和青霉噻唑酸殘留的檢測方法，此方法靈敏度高、線性范圍好、回收率和重現(xiàn)性好，能滿足獸藥殘留檢測的要求，可為快速準確的檢測該類藥物提供可靠的技術(shù)支撐。

［1］ 李俊鎖，邱月明，王 超.獸藥殘留分析［M］.上海：上海科學技術(shù)出版社，2002：641－644.

［2］ 農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號［Z］.北京：農(nóng)業(yè)部，2002.

［3］ Bailón Pérez M I，Garc?a Campa?a A M，Del Olmo Iruela M，et al.Trace determination of 10β－lactam antibiotics in environmental and food samples by capillary liquid chromatography［J］.J Chromatogr A，2009，1216（47）：8355－8361.

［4］ Zhang X，Chen L，Xu Y，et al.Determination ofβ－lactam antibiotics in milk based on magnetic molecularly imprinted polymer extraction coupled with liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogra B，2010，878（32）：3421－3426.

［5］ 章 敏，黃顯會，楊 剛，等.牛奶中氯唑西林殘留量的高效液相色譜法測定［J］.動物醫(yī)學進展，2012，33（6）：56－60.

［6］ Kress C，Schneider E，Usleber E，et al.Determination of penicillin and benzylpenicillic acid in goat milk by enzyme immunoassays［J］.Small Ruminant Res，2011，96（2）：160－164.

［7］ 陳 聰，嚴 慧，沈保華，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定全血中青霉素G及其主要代謝產(chǎn)物［J］.色譜，2012，30（5）：445－451.

［8］ 劉創(chuàng)基，王 海，杜振霞，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛肉中青霉素類藥物及其代謝產(chǎn)物［J］.分析化學，2011，39（5）：617－622.

［9］ 馮月超，范筱京，賈 麗，等.液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測定牛奶中14種青霉素及相應青霉噻唑酸殘留量［J］.分析試驗室，2012，31（9）：67－70.

［10］ Matuszewski B K，Constanzer M L，Chavez－Eng C M，et al.Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC－MS／MS［J］.Analy Chem，2003，75（13）：3019－3030.

［11］ Camara M，Gallego－Pico A，Garcinuno R M，et al.An HPLC－DAD method for the simultaneous determination of nineβ－lactam antibiotics in ewe milk［J］.Food Chem，2013，141（2）：829－834.

［12］ Candioti V L，Olivieri A C，Goicoechea H C，et al.Development of a novel strategy for preconcentration of antibiotic residues in milk and their quantitation by capillary electrophoresis［J］.Talanta，2010，82（1）：213－221.

［13］ Liu C J，Wang H，Jiang Y B，et al.Rapid and simultaneous determination of amoxicillin，penicillin G，and their major metabolites in bovine milk by ultra－h(huán)igh－performance liquid chro－matography－tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogra B，2011，879，533－540.

［14］ 黃百芬，吳丹青，蔡增軒，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶中19種β－內(nèi)酰胺類抗生素［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010（1）：1－6.

［15］ Junza A，Amatya R，Barron D，et al.Comparative study of the LC－MS／MS and UPLC－MS／MS for the multi－residue analysis of quinolones，penicillins and cephalosporins in cow milk，and validation according to the regulation 2002／657／EC［J］.J Chromatogra B，2011，879（25）：2601－2610.

［16］ Macarov C A，Tong L，Martinez－Huelamo M，et al.Multi residue determination of the penicillins regulated by the European Union，in bovine，porcine and chicken muscle，by LCMS／MS［J］.Food Chem，2012，135（4）：2612－2621.

［17］ 邱增枝，鄭增忍，趙思俊，等.UPLC－MS／MS法測定豬尿中β－2受體激動劑的基質(zhì)效應研究［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34（9）：66－70.