川芎嗪對實驗性骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)液中NO和PGE2的調(diào)節(jié)作用

梁桂洪，孫 赫，黃宇新，林勇凱，梁祖建

（1.廣州中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州 510240）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是骨傷科臨床上的常見病和多發(fā)病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、功能障礙，其主要病理特征是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)病緩慢，漸進性退變，是一種嚴重影響老年人健康的疾病，其在力學因素和生物學因素的共同作用下導致軟骨細胞、細胞外基質(zhì)、軟骨下基質(zhì)3者降解和合成失衡[1]。目前骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制仍不確切[2]。在其病理進程中，NO參與了炎癥反應(yīng)。在關(guān)節(jié)軟骨降解中，PGE2是最主要的分解代謝因子之一[3]，并參與炎癥反應(yīng)、致痛、影響血管擴張及生成，從而產(chǎn)生癥狀。有中醫(yī)學者認為氣滯血淤是OA發(fā)病機制之一，川芎是一種廣泛應(yīng)用于臨床治療的常用中藥，具有活血行氣、祛風止痛的作用，川芎嗪為川芎的主要有效成分，現(xiàn)代研究表明其具有清除氧自由基、鈣拮抗、擴血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用[4]。已有學者用川芎嗪關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療膝骨關(guān)節(jié)炎，長期療效較為可靠[5]。本研究擬通過測定OA大鼠模型膝關(guān)節(jié)液中NO、PGE2的含量，探討川芎嗪在減緩OA炎癥的發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為臨床上治療OA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康雌性SD大鼠24只，體重180g～220g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 NO、PGE2試劑盒，廣州齊云生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 藥物制備 鹽酸川芎嗪注射液20mg／mL，無錫市第七制藥有限公司產(chǎn)品（批號：H32023383），參照臨床，劑量為每天7.19mg／kg，采用關(guān)節(jié)腔注射；氯化鈉注射液，上海華原股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將動物隨機分為假手術(shù)組、OA模型空白組、川芎嗪組，每組8只，用100g／L水合氯醛溶液按3.5mL／kg腹腔注射，5min后完全麻醉，OA模型空白組和川芎嗪組經(jīng)背部切口切除大鼠雙側(cè)卵巢，切斷右膝內(nèi)側(cè)副韌帶及交叉韌帶，行抽屜試驗陽性后徹底止血，逐層縫合；假手術(shù)組經(jīng)背部切口將大鼠卵巢從腹腔提出，僅切除卵巢周圍少量脂肪，不切除卵巢，切開右膝關(guān)節(jié)處皮膚，不做其他處理后即縫合。所有傷口在縫合前均滴入少量的青霉素溶液。術(shù)后連續(xù)4d肌肉注射青霉素4萬單位／d。第5天起每天驅(qū)趕動物奔跑30min，其余時間任其籠內(nèi)自由活動。

1.2.2 治療方法 術(shù)后4周開始每次給川芎嗪組關(guān)節(jié)腔注射鹽酸川芎嗪注射液0.36mL／kg。OA模型空白組、假手術(shù)組關(guān)節(jié)腔注射等量的生理鹽水，每周2次，連續(xù)注射4周。

1.2.3 飼養(yǎng)環(huán)境 術(shù)后分籠飼養(yǎng)，所有SD大鼠均喂養(yǎng)在恒溫、恒濕的清潔環(huán)境中，環(huán)境溫度為25℃±1℃，濕度為68%，每天12h光照／黑暗，任意進食飼養(yǎng)者提供的大鼠標準飼料和自來水。

1.2.4 觀察指標 各組于術(shù)后第4、8周抽取各組關(guān)節(jié)液進行NO、PGE2含量測定。

1.2.5 指標檢測方法 NO、PGE2檢測，參照試劑盒方法進行操作。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（ˉx±SD）表示，多組比較符合正態(tài)性和方差齊性用方差分析，不符合正態(tài)性或方差齊性用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用X2檢驗；等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)液中的NO含量測定

術(shù)后4周，OA模型空白組與川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01），OA模型空白組關(guān)節(jié)液中的NO與川芎嗪組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.10）；術(shù)后8周OA模型空白組關(guān)節(jié)液中的NO較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01）；術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO較術(shù)后4周明顯減少（P＜0.01）；術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO較OA模型空白組明顯減少（P＜0.05）；術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.10）（表1）。

2.2 關(guān)節(jié)液中的PGE2含量測定

術(shù)后4周，OA模型空白組與川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的PGE2較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01）；OA模型空白組關(guān)節(jié)液中的PGE2與川芎嗪組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.10）；術(shù)后8周PGE2模型空白組關(guān)節(jié)液中的PGE2較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01）；術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的PGE2較術(shù)后4周明顯減少（P＜0.01）；術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的PGE2較OA模型空白組明顯減少（P＜0.05）；術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的PGE2與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.10）（表2）。

表1 術(shù)后4周、8周關(guān)節(jié)液中的NO含量測定Table1 Determination of NO content in the fluid within joints after operation 4weeks and 8weeks μmol／L

表2 術(shù)后4周、8周關(guān)節(jié)液中的PGE2含量測定Table2 Determination of PGE2content in the fluid within joints after operation 4weeks and 8weeks μmol／L

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查[6]，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病人口已達10%左右，其發(fā)病率和年齡成正相關(guān)。OA的發(fā)病機理非常復(fù)雜，至少遠未達到可以研究清楚的程度，而滑膜炎癥與關(guān)節(jié)退變在本病的發(fā)生發(fā)展過程中占有重要的地位。研究表明OA發(fā)生時，各種細胞因子及軟骨降解產(chǎn)物的強烈刺激使NO水平升高，而過多的NO不但可協(xié)同其他細胞因子增加軟骨損害，而且可增強基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，促進軟骨蛋白聚糖和膠原的裂解[7]。NO的大量釋放又進一步促進炎性細胞因子釋放，從而抑制軟骨細胞分泌細胞外基質(zhì)，影響Ⅱ型膠原合成[8]，最終導致軟骨的質(zhì)量因營養(yǎng)障礙，不斷下降和進行性退化。反之，NO還可促進IL－1介導軟骨降解作用，減少軟骨細胞合成IL－1Ra，影響基質(zhì)生物合成。而且NO在滑膜炎的形成中也起著重要的作用，滑膜中高含量的NO可引起滑膜組織的損傷和血管擴張、血管壁的通透性增大而引起滲出，導致滑膜腫脹、充血及關(guān)節(jié)內(nèi)的粒細胞滲出，形成關(guān)節(jié)積液，從而引起關(guān)節(jié)的腫脹、疼痛。另外，NO還可導致軟骨細胞發(fā)生凋亡[9]。PGE2是由活化磷脂酶 A2 （phospholipase A2，PLA2）分解膜磷脂產(chǎn)生花生四烯酸氨基酸，在環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）和前列腺素E合成酶（prostaglandin E synthase，PGES）作用下形成的。炎性介質(zhì)IL－1和TNF－α能誘導和激活PLA2，活化花生四烯酸代謝途徑，促使PGE2合成增加。PGE2還可舒張小血管，增加微循環(huán)通透性.增加滲出與水腫，誘導白細胞聚集，加重滑膜炎癥反應(yīng)，并參與軟骨下骨重塑[10]，PGE2又可進一步加強IL－1對軟骨的分解作用，使滑膜細胞與浸潤性炎性細胞反應(yīng)性增強。同時PGE2通過細胞間環(huán)腺苷酸積累，直接誘導軟骨細胞凋亡，增加破骨細胞形成，促進骨吸收。有研究表明，臨床上可以通過抽取并檢測膝關(guān)節(jié)液中MMP－3和PGE2的含量，作為早期診斷OA的重要指標[11]。由此可見，NO、PGE2對OA疾病發(fā)生發(fā)展及病理過程具有重要的影響。

川芎是一種廣泛應(yīng)用于臨床治療的常用中藥，具有活血行氣、祛風止痛的作用，被譽為血中之氣藥。川芎嗪來源于傘形科植物川芎（Ligusticum wallichii）的干燥根莖，其化學結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，具有典型的鈣離子拮抗劑的特性。研究表明川芎嗪有解痙、強烈抑制血小板凝集、擴張血管、改善微循環(huán)、降低全血黏度、改善血液流變學、清除自由基、抑制細胞凋亡、抗炎消腫、降低心肌耗氧等多種作用[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為OA的病因與骨內(nèi)靜脈淤滯、骨內(nèi)高壓有密切聯(lián)系，活血化瘀類藥物具有改善骨內(nèi)血液流變學和血流動力學狀態(tài)，降低骨內(nèi)高壓，改善骨內(nèi)微循環(huán)的作用，能從根本上治療本病?？赂叻宓萚12]通過比較活血法、溫經(jīng)法、補肝腎法和活血溫經(jīng)補肝腎法對膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜中NO、TL－6濃度的影響，發(fā)現(xiàn)活血藥更能抑制OA早期模型滑膜中NO、TL－6的濃度，更能緩解關(guān)節(jié)炎發(fā)展，對于緩解骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀的效果更好。而且川芎嗪治療OA的臨床與試驗研究已有相關(guān)報道。王文瑞等[13]觀察了川芎嗪對膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的保護作用，發(fā)現(xiàn)川芎嗪改善了關(guān)節(jié)周圍組織的血液淤滯狀態(tài)，使血流暢通，局部組織的理化環(huán)境恢復(fù)正常，提高關(guān)節(jié)軟骨SOD活性，糾正了氧自由基代謝紊亂。王鎖良等[14]通過比較激素類藥物以及川芎嗪關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對骨關(guān)節(jié)炎過程中軟骨退變的作用，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射川芎嗪能減輕兔膝關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)軟骨退變程度，并可促進軟骨的自身修復(fù)。何建新等[15]通過試驗研究表明川芎嗪可通過刺激TIMP－1的合成，降低軟骨基質(zhì)中 MMP－13mRNA表達，延緩了軟骨細胞的退變和基質(zhì)的降解，從而起到了防治骨性關(guān)節(jié)炎的作用。洪昆達[16]通過研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔注射川芎嗪后可能是通過調(diào)節(jié)機體炎癥因子的表達，以及促進軟骨細胞增殖與抑制軟骨細胞調(diào)亡，起到保護軟骨的作用，從而有效地緩解了疲血阻絡(luò)型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者的臨床癥狀。張卓等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可能是通過抑制了MMPs的活性，抑制軟骨基質(zhì)中蛋白多糖的丟失過程，從而起到抑制關(guān)節(jié)退變的作用。為此，本研究選用了川芎嗪作為治療藥物。

本試驗研究結(jié)果顯示，術(shù)后8周，關(guān)節(jié)液中NO、PGE2的水平在川芎嗪組中表達均較OA模型空白組及術(shù)后第4周川芎嗪組明顯減弱（P＜0.05，P＜0.01）；OA模型空白組及川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO、PGE2均較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01）；術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO、PGE2與假手術(shù)組比較均無統(tǒng)計學差異（P＞0.10）。因此，我們推測川芎嗪能通過抑制NO、PGE2的生成從而緩解了OA炎癥的發(fā)展，對OA起到抗炎、鎮(zhèn)痛的防治作用。綜上所述，關(guān)節(jié)腔注射川芎嗪治療OA效果可靠，操作簡便，值得臨床推廣應(yīng)用。有關(guān)劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系的對照研究、動態(tài)的觀察川芎嗪對OA炎癥發(fā)生發(fā)展進展的影響和最佳治療劑量，有待于進一步研究。

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