烏骨雞黑色素三步法提取及結(jié)構(gòu)性狀研究

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(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047； 2.南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江西南昌 330029)

烏骨雞黑色素三步法提取及結(jié)構(gòu)性狀研究

黃宇玫2,田穎剛1,*,朱勝1

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047； 2.南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江西南昌 330029)

采用“脫脂-酶解-酸解”三步法提取烏骨雞黑色素,研究酸液脫除蛋白,分離烏骨雞黑色素的工藝條件,通過透射電鏡對(duì)烏骨雞黑色素純化效果進(jìn)行觀察,并用元素分析儀對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：最佳脫脂工藝為乙醇回流脫脂4次,每次1h,料液比1∶2,此工藝條件下烏骨雞油脂得率7.5%。脫脂后用蛋白酶C進(jìn)行酶解,酸化的最優(yōu)工藝鹽酸濃度為2mol/L,回流時(shí)間為3h,固液比為1∶10,回流次數(shù)為4次,此條件下雜質(zhì)脫除率最高,且條件溫和,通過透射電鏡可見三步法純化的黑色素顆粒形態(tài)完整,邊緣清晰平滑,無破壞痕跡,可用于降解和結(jié)構(gòu)研究。根據(jù)元素分析儀推測(cè)烏骨雞黑色素是一類有別于真黑色素及脫黑色素的特殊黑色素。

烏骨雞,黑色素,提取,酶解,結(jié)構(gòu)

烏骨雞是江西省重要的地方資源,它與其他雞種最大的區(qū)別在于其體內(nèi)富含黑色素。李時(shí)珍在本草綱目里說,骨頭與肉都呈黑色的烏骨雞食用時(shí)藥效最好,由此說明烏骨雞黑色素是烏骨雞發(fā)揮藥效的一個(gè)最重要的物質(zhì)基礎(chǔ),而近代科研工作者也發(fā)現(xiàn)烏骨雞黑色素具有許多特殊的生理活性,如抗誘變、延緩衰老、抑制流感病毒等[1-3]。因此,烏骨雞黑色素具有潛在的研究與應(yīng)用價(jià)值。烏骨雞黑色素是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜且與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的大分子多聚體[4]。目前,提取烏骨雞黑色素的方法主要有鹽酸水解法[5]、蛋白酶水解法[6]及雙酶水解結(jié)合堿液除蛋白法等[7]。這些方法在提取烏骨雞黑色素時(shí)只考慮了烏骨雞黑色素獲得,而忽略了對(duì)烏骨雞的綜合利用。本文結(jié)合前人的工作基礎(chǔ),運(yùn)用“脫脂-酶解-酸解”三步法,為烏骨雞的深入研究與開發(fā)提供借鑒,為促進(jìn)江西省烏骨雞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,深入開發(fā)我國(guó)特有資源做一些基礎(chǔ)性研究。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

烏骨雞 70～80日齡,雌雄各半,購(gòu)自江西泰和縣；木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶 廣東諾維信酶制劑有限公司；無水乙醇、氯仿、甲醇、石油醚、無水乙醚、鹽酸、酚酞、氫氧化鈉 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SXC12型絞肉機(jī) 上海雙蝶廚具有限公司大溪分公司；XB220A電子分析天平 瑞士Prcisa；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；SHB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)陳科工貿(mào)易有限公司；Anke TGL-16C 離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SPI型傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Perkin-Elmer；HITACHI H-600型透射電子顯微鏡 日本日立；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；EuroVector EA3000元素分析儀 美國(guó)利曼;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;WH-861 微型漩渦混合儀 江西省日博工貿(mào)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 烏骨雞原料脫脂工藝的優(yōu)選 取泰和烏骨雞,宰殺,去毛、頭、爪、內(nèi)臟,洗凈,用絞肉機(jī)絞成肉泥,加入無水乙醇,90℃回流,趁熱過濾,濾液濃縮并60℃真空干燥,得烏骨雞油脂,濾渣60℃烘干得烏骨雞干肉[8]。

選擇回流次數(shù)、肉泥與無水乙醇的料液比、回流時(shí)間作為考察的因素,以所提油的得率為指標(biāo),采用L16(45)正交表安排實(shí)驗(yàn),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性判斷,以確定降解方法的最優(yōu)組合,正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1,相關(guān)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.2 酶解制備粗黑色素的5種不同的蛋白酶及蛋白酶組合 取1.2.1最優(yōu)條件所獲烏骨雞干肉6份,每份100g,加入6倍質(zhì)量的水,90℃預(yù)煮30min,冷卻至一定溫度,參考文獻(xiàn)[9],分別選擇蛋白酶A-E進(jìn)行水解,保溫?cái)嚢?h后90℃滅酶30min,趁熱過濾,濾液濃縮并于60℃下真空干燥,稱重,即獲得烏骨雞活性肽,濾渣烘干。以蛋白脫除率為指標(biāo)初步篩選合適蛋白酶,蛋白酶用量及水解溫度見表2。

蛋白脫除率(%)=烏骨雞干肉重(g)-酶解殘?jiān)?g)/烏骨雞干肉重(g)×100

表2 蛋白酶用量及其水解溫度

1.2.3 鹽酸酸解純化烏骨雞黑色素工藝條件的確定 烏骨雞黑色素與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密,提取得到的烏骨雞黑色素粗品中含有大量的蛋白質(zhì),因此烏骨雞黑色素的分離關(guān)鍵是脫除蛋白質(zhì),本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸酸解純化烏骨雞黑色素,分別對(duì)鹽酸濃度、回流時(shí)間、固液比、回流次數(shù)4個(gè)指標(biāo)做單因素考察,以雜質(zhì)脫除率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.3.1 鹽酸濃度單因素實(shí)驗(yàn) 稱取干燥黑色素粗品6份,每份6g,分別加入濃度為0.5、1、2、4、6、8、10mol/L的鹽酸溶液60mL,于90℃回流3h,冷卻后過濾,濾液濃縮、水浴蒸干,稱重,濾渣用蒸餾水洗滌至中性,60℃烘干。計(jì)算各組分雜質(zhì)脫除率。

1.2.3.2 回流時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn) 稱取干燥黑色素粗品5份,每份6g,加入濃度為2 mol/L的鹽酸溶液60mL,于90℃分別回流1、2、3、4、5h,冷卻。濾液中干物質(zhì)處理同1.2.3.1。

1.2.3.3 固液比單因素實(shí)驗(yàn) 稱取干燥黑色素粗品5份,每份6g,分別以固液比為1∶4、1∶7、1∶10、1∶13、1∶16的比例加入2mol/L的鹽酸溶液,于90℃回流3h,冷卻。濾液中干物質(zhì)處理同1.3.3.1。

1.2.3.4 回流次數(shù)單因素實(shí)驗(yàn) 稱取干燥的黑色素粗品一份20g,以固液比1∶10的比例加入2mol/L的鹽酸溶液,90℃回流3h,冷卻,過濾。重復(fù)5次,濾液分別濃縮、水浴蒸干,稱重。濾渣用蒸餾水洗滌至中性,60℃烘干。計(jì)算雜質(zhì)脫除率。

1.2.4 研究烏骨雞黑色素的理化性質(zhì)

1.2.4.1 不同方法精制的烏骨雞黑色素形態(tài)觀察 比較雙酶-堿液脫除蛋白法、本項(xiàng)目?jī)?yōu)化的脫脂-酶解-酸解三步精制法、酸提取法所得黑色素的形態(tài)差別。酸提取法：將烏骨雞雞肉、雞皮剁細(xì)后用6mol/L鹽酸按40mL/g比例浸泡8.0h,然后100℃水浴回流1.5h,在加熱回流后進(jìn)行快速冷凍,用小匙除去其油塊得到烏骨雞黑色素。

雙酶-堿液脫除蛋白法：取泰和烏骨雞肉泥加3倍的水,0.25%的木瓜蛋白酶,(63±1)℃酶解3h,降溫至(54±1)℃,再加入0.15%的復(fù)合蛋白酶,繼續(xù)酶解2h,升溫煮沸0.5h,滅酶,靜置分層,抽出上層黑色素懸浮液,在4800r/min條件下離心15min,棄去上清液,得黑色素粗品。取酶解后黑色素粗品5g,加入pH10的氫氧化鈉溶液50mL,50℃水浴加熱并攪拌2h,離心后得烏骨雞黑色素。

脫脂-酶解-酸解三步精制法：取泰和烏骨雞肉泥加2倍的無水乙醇,90℃回流4次,每次1h,趁熱過濾,濾渣60℃烘干得烏骨雞干肉。干肉加入6倍質(zhì)量的水,90℃預(yù)煮30min,冷卻至一定溫度,選擇蛋白酶C進(jìn)行水解,保溫?cái)嚢?h后90℃滅酶30min,趁熱過濾,濾液濃縮并于60℃下真空干燥得黑色素粗品,稱取酶解后黑色素粗6g 至反應(yīng)瓶,加入濃度為2mol/L的鹽酸溶液60mL,90℃回流3 h,冷卻后過濾,濾渣用蒸餾水洗滌至中性,60℃烘干得烏骨雞黑色素。

取少量干燥的三種精制烏骨雞黑色素,與適量乙醇混合,用超聲的方法將樣品盡量分散成均勻混合液,用玻璃毛細(xì)管吸取混合液滴2～3滴在微柵網(wǎng)上,置HITACHI H-600型透射電鏡下進(jìn)行觀察并記錄,工作電壓75kV。

1.2.4.2 元素分析 取少量干燥的脫脂-酶解-酸解三步法精制烏骨雞黑色素按JY/T 017-1996 元素分析儀通則[10]進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2. 1正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

烏骨雞雞肉乙醇脫脂的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表3、表4。由表3的極差分析結(jié)果可知,三個(gè)因素的主次順序?yàn)椋夯亓鞔螖?shù)>回流時(shí)間>料液比。根據(jù)極差分析得到的烏骨雞油得率最高的條件是：回流次數(shù)為4次,回流時(shí)間為1h,料液比為1∶2。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,在此條件下,烏骨雞油脂得率為7.5%。根據(jù)方差分析結(jié)果可知：各因素在正交實(shí)驗(yàn)所選水平下,對(duì)烏骨雞油脂得率都有影響,回流次數(shù)對(duì)其影響顯著(p<0.05),但回流時(shí)間和料液比對(duì)其影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表

2. 2各種蛋白酶對(duì)蛋白的脫除效果

要獲得比較純凈的黑色素,就必須盡可能的將與黑色素緊密相連的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除。蛋白酶A、B、C、D、E及復(fù)合酶D+E的水解效果如圖1。由結(jié)果可知,蛋白酶C的蛋白脫除率最高,可達(dá)59.79%,因此,選擇蛋白酶C進(jìn)行蛋白脫除。

圖1 各種蛋白酶對(duì)蛋白的脫除效果

2.3烏骨雞黑色素的提取工藝考察結(jié)果

2.3.1 鹽酸濃度對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響 鹽酸濃度對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響見圖2,由圖可知,鹽酸濃度小于1mol/L時(shí),鹽酸濃度的變化對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響不大；當(dāng)鹽酸濃度大于1mol/L時(shí),隨著濃度的增加,雜質(zhì)脫除率顯著提高；在2mol/L處,脫除率顯著增加,達(dá)到48.25%；繼續(xù)增加鹽酸濃度,雜質(zhì)脫除率有緩慢增加的趨勢(shì)。但鹽酸濃度太大可能會(huì)對(duì)黑色素的結(jié)構(gòu)造成破壞,且在實(shí)驗(yàn)操作方面有較大的危險(xiǎn)性,綜合以上因素,選擇2mol/L為最佳鹽酸濃度。

圖2 鹽酸濃度對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響

2.3.2 回流時(shí)間對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響 回流時(shí)間對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響見圖3,由圖可知,回流時(shí)間在3h之內(nèi),雜質(zhì)脫除率呈大幅增高的趨勢(shì),且在該段時(shí)間內(nèi)雜質(zhì)脫除率與回流時(shí)間幾乎成線性關(guān)系。回流3h后,雜質(zhì)脫除率無明顯增加,說明在此條件下即使增加回流時(shí)間也無法提高雜質(zhì)的脫除率,一個(gè)原因可能隨時(shí)間的延長(zhǎng)反應(yīng)液中鹽酸濃度已經(jīng)降低,已經(jīng)無法繼續(xù)水解雜質(zhì)；另外一個(gè)原因是該鹽酸濃度已經(jīng)無法水解一些特殊的蛋白及以特殊結(jié)構(gòu)連接在黑色素上的蛋白。因此,選擇3h為最佳回流時(shí)間。

2.3.3 固液比對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響 固液比對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響見圖4,由圖可知,固液比在1∶4至1∶10之間,雜質(zhì)脫除率呈逐漸增高的趨勢(shì),當(dāng)固液比達(dá)到1∶10后,隨著固液比的增大雜質(zhì)脫除率增加非常緩慢,幾乎不變,從經(jīng)濟(jì)角度考慮選擇1∶10為最佳固液比。

圖3 酸解時(shí)間對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響

圖4 固液比對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響

2.3.4 回流次數(shù)對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響 回流次數(shù)對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響見圖5,由圖可知,隨著回流次數(shù)的增加,雜質(zhì)脫除率不斷增加,但在初始階段(回流1～3次),雜質(zhì)脫除率與回流次數(shù)幾乎呈線性正相關(guān),當(dāng)回流3次后,雜質(zhì)脫除率趨于平緩,說明此時(shí)增加回流次數(shù)對(duì)雜質(zhì)脫除率已無太大的影響。結(jié)合圖6可知,當(dāng)雜質(zhì)脫除率與回流次數(shù)成正相關(guān)時(shí),烏骨雞黑色素粗品中含氮百分率與回流次數(shù)正好成負(fù)相關(guān),說明脫除的雜質(zhì)中含有大量的氮元素,可能是包裹在烏骨雞黑色素周圍的蛋白質(zhì),當(dāng)回流次數(shù)超過4次后,烏骨雞黑色素粗品中氮含量變化基本趨于平緩,考慮到蛋白含量太高會(huì)影響后期實(shí)驗(yàn)中烏骨雞黑色素的降解及其降解產(chǎn)物的分離,為盡量減少雜質(zhì)的干擾,因此,選擇最佳回流次數(shù)為4次。

圖5 回流次數(shù)對(duì)雜質(zhì)脫除率的影響

圖6 回流次數(shù)對(duì)烏骨雞黑色素粗品氮含量的影響

2.4烏骨雞黑色素性狀的分析結(jié)果

2.4.1 不同方法精制的烏骨雞黑色素的形態(tài)比較 如圖7所示,在透射電鏡下各種不同方法精制的烏骨雞黑色素形態(tài)不同,采用雙酶-堿液脫除蛋白法提取的黑色素(圖中E-Alkali)在12000倍電鏡下呈現(xiàn)塊狀形態(tài),塊狀邊緣棱角分明；采用本項(xiàng)目?jī)?yōu)化的三步精制法所獲烏骨雞黑色素(圖中E-Acid)在12000倍時(shí)呈現(xiàn)為多個(gè)橢圓形顆粒的聚合物,且多聚體邊緣呈現(xiàn)為橢圓形凹凸不平狀,可隱約觀察到黑色素顆粒形態(tài)。在40000倍電鏡下與酸法提取的烏骨雞黑色素(圖中Acid)進(jìn)行對(duì)比,黑色素顆粒數(shù)明顯較多,其外部形態(tài)基本相似,這些橢球形顆粒形態(tài)完整,邊緣清晰平滑,無破壞痕跡,可為后期烏骨雞黑色素結(jié)構(gòu)研究提供了性質(zhì)穩(wěn)定、純凈的原料來源。

圖7 烏骨雞黑色素透射電鏡圖

2.4.2 精制烏骨雞黑色素的元素分析 元素分析表明,精制烏骨雞黑色素中C、H、N三種元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近于合成真黑色素,但其S元素的含量高于合成真黑色素,又遠(yuǎn)低于脫黑色素。表明烏骨雞黑色素可能是一類以真黑色素結(jié)構(gòu)為主混合著少量脫黑色素結(jié)構(gòu)的一類特殊黑色素。且烏骨雞黑色素C元素的含量略高于其它兩類黑色素,推測(cè)其含有脂肪族結(jié)構(gòu)。

表5 三類黑色素中有機(jī)元素質(zhì)量百分比

3 結(jié)論與討論

目前烏骨雞黑色素的結(jié)構(gòu)尚不明確,被認(rèn)為是一類與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密,且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子多聚體[11-14]。鹽酸水解法是早期使用較為廣泛的提取黑色素的方法,鹽酸可有效去除附著于黑色素周圍的蛋白,但該法使用的鹽酸濃度較高、酸解時(shí)間較長(zhǎng),可能會(huì)對(duì)黑色素的外部形態(tài)及內(nèi)部化學(xué)結(jié)構(gòu)造成破壞。因此有學(xué)者開始采用蛋白酶酶解技術(shù)提取黑色素。酶水解法水解溫和,能盡量保持黑色素結(jié)構(gòu),但使用該法所獲黑色素的蛋白質(zhì)含量較高,其純度往往不及鹽酸水解法所獲黑色素,這給黑色素的結(jié)構(gòu)研究帶來極大的不便。前期本課題組在此基礎(chǔ)上采用雙酶水解結(jié)合堿液除蛋白的方法提取分離烏骨雞黑色素,該法只能一定程度上脫除黑色素周圍的部分蛋白,制備的黑色素較適合進(jìn)行功能研究,由于蛋白脫除不徹底不利于黑色素結(jié)構(gòu)研究。本實(shí)驗(yàn)提出的“脫脂-酶解-酸解”三步法可將附著在烏骨雞黑色素周圍的蛋白質(zhì)去除干凈,投射電鏡下可觀察到游離的規(guī)則橢球顆粒的烏骨雞黑色素,表明此法所獲得的烏骨雞黑色素周圍無明顯附著物,減少了多余蛋白質(zhì)對(duì)烏骨雞黑色素結(jié)構(gòu)分析的影響,可為后期烏骨雞黑色素的結(jié)構(gòu)研究提供較為純凈、性質(zhì)穩(wěn)定的原材料。

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Three stage extraction and structural characters of melanin from black-bone silky fowl

HUANGYu-mei2,TIANYing-gang1,*,ZHUSheng1

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China; 2.Nanchang University College of Science and Technology,Nanchang 330029,China)

This study aimed to develop a method to extract melanin from black-bone silky fowl muscle by Skim-enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis,to find better separation conditions of black-bone silky fowl melanin. The melanin was observed by Transmission Electron Microscope,and analyzed by element analyzer. The optimal conditions for protamex hydrolysis of black-bone silky fowl muscle were determined as follows:refluxing 4 times,refluxing time 1h,and solid-liquid ratio 1∶2.Under this condition the removal rate was 7.5%.Then it was found that more melanin with a lower protein level was prepared from black-bone silky fowl muscle by the protease C,optimal acidification condition was hydrochloric concentration 2mol/L,refluxing time 3h,liquid-solid ratio 1∶10,refluxing 4 times. Under this condition of the impurity removal rate was the highest. Through transmission electron microscopy the melanin by three-step purified was ellipsoidal and shape integrity particle,with clear and smooth borderline and without destruct. Element analysis of melanin showed that the melanin from black-bone silky fowl might be a specail melanin which was different with eumelanin and phomelanin.

black-bone silky fowl;melanin;extraction;enzymatic;structure

2013-06-28 *通訊聯(lián)系人

黃宇玫(1983-)，女，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物提取及藥效研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20962015)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009GZN0087)；江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ10308)。

TS251.55

：B

：1002-0306(2014)01-0249-05