裙帶菜孢子多糖的體內(nèi)抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性

奚 倩，赫 丹，韓 眾 鑫，余 洋 定，孫 黎 明，趙 雅 娉，張 警 予，啟 航

(1.大連工業(yè)大學 食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034；3.丹東市振安區(qū)種子管理站，遼寧 丹東 118000；4.丹東市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗監(jiān)測中心，遼寧 丹東 118000)

0 引 言

裙帶菜、海帶等褐藻含有豐富的礦物質(zhì)、維生素和膳食纖維[1]，常被加工成保持身體健康的多功能食品，在東亞地區(qū)深受歡迎。我國是世界上藻類產(chǎn)量最多的國家。2012年，中國的藻類產(chǎn)量達到179.7萬t(干重)，其中大部分是裙帶菜和海帶[2]。裙帶菜加工過程中，其孢子葉常被當作廢棄物處理，造成了資源的極大浪費和環(huán)境污染。裙帶菜和海帶中的褐藻多糖硫酸酯具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗凝血等活性[3－6]。2003年 Katatsube等[7]提取了裙帶菜孢子葉多糖，并研究了其抑制透明質(zhì)酸酶的活性；2004年Lee等[1]發(fā)現(xiàn)裙帶菜孢子葉多糖具有抗病毒活性；2007年Kim等[8]研究了韓國裙帶菜孢子葉多糖的抗凝血活性；2010年You等[9]報道了裙帶菜孢子葉多糖的體外抗氧化活性；Synytsya等[10]報道了韓國裙帶菜孢子葉多糖的抗腫瘤活性。然而，裙帶菜孢子葉多糖體內(nèi)抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性，至今鮮見報道。多糖的抗腫瘤活性很可能是通過刺激免疫的機制實現(xiàn)的[11]。因此，本文建立研究裙帶菜孢子葉多糖的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用對于研究多糖的生理活性功能、開發(fā)相關的功能性產(chǎn)品具有一定的現(xiàn)實意義。

1 材料和方法

1.1 原料與試劑

裙帶菜孢子葉多糖粗提液，大連水產(chǎn)養(yǎng)殖集團有限公司；昆明種小白鼠(18～22g，5～6周)、綿羊紅細胞(SRBC)，大連醫(yī)科大學動物實驗中心；RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、3－(4，5－二甲基－2－基)－2，5－二苯基溴(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、絲裂霉素C(MMC)，Gibco Invitrogen；臺盼藍，Amresco公司(美國)；香菇多糖，Sigma化學有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。其他試劑均為分析純。

1.2 儀 器

PHS－3C型pH計，上海鵬順科學儀器有限公司；LIM－2A低速離心機，北京醫(yī)用離心機廠；HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SP－756紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；Bio－Rad 680酶標儀，美國Bio－Rad公司；倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司。

1.3 方 法

1.3.1 裙帶菜孢子葉多糖精制

裙帶菜孢子葉多糖粗提液經(jīng)乙醇沉淀，5 000g離心10min，收集沉淀，凍干保存?zhèn)溆谩＞坪笕箮Р随咦尤~多糖質(zhì)量分數(shù)為34.25%。單糖組成為巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和鼠李糖，含量最多的是巖藻糖[12]。

1.3.2 體內(nèi)抗氧化能力檢測

1.3.2.1 實驗動物分組及處理

昆明種小白鼠72只(18～22g，雌性)隨機分成6組，每組12只，飼養(yǎng)于空調(diào)溫室內(nèi)，溫度(20±1)℃，光照12h，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

造模：小鼠隨機分成的6組分別為空白對照組、陰性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組。除空白對照組每日灌胃等體積生理鹽水外，其他5組連續(xù)腹腔注射D－半乳糖30d，劑量120mg／kg，注射量為0.01mL／g，1次／d，第31天刺眼眶取血，測定血清中MDA水平，確定氧化損傷動物模型建成。之后，除空白對照組外，其他5組分別按下述劑量連續(xù)灌胃給藥：陰性對照組(生理鹽水)、低劑量組(裙帶菜孢子葉多糖50mg／kg)、中劑量組(裙帶菜孢子葉多糖150mg／kg)、高劑量組(裙帶菜孢子葉多糖300mg／kg)、陽性對照組(香菇多糖300mg／kg)，給藥量為0.01mL／g，1次／d。給藥過程中繼續(xù)腹腔注射D－半乳糖。連續(xù)灌胃45d后摘眼球取血，離心10min(4 000r／min)取血清；頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟和腦，并制備其勻漿液，進行相關抗氧化能力檢測。

1.3.2.2 抗氧化能力檢測

采用試劑盒檢測血清、肝組織和腦組織勻漿液中SOD、MDA、GSH－Px。

1.3.3 體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)能力檢測

1.3.3.1 實驗動物分組及處理

昆明種小白鼠60只(18～22g，雌性)隨機分成5組，每組12只，飼養(yǎng)于空調(diào)溫室內(nèi)，溫度(20±1)℃，光照12h，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。各組分別按下述劑量連續(xù)灌胃：陰性對照組(生理鹽水)、低劑量組(裙帶菜孢子葉多糖50mg／kg)、中劑量組(裙帶菜孢子葉多糖150mg／kg)、高劑量組(裙帶菜孢子葉多糖300mg／kg)、陽性對照組(香菇多糖300mg／kg)，給藥量為0.01mL／g，1次／d。連續(xù)灌胃45d，第46天進行免疫功能檢測。

1.3.3.2 小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)

小鼠頸椎脫臼處死，稱取小鼠體重、脾臟及胸腺質(zhì)量。根據(jù)以下公式計算脾臟指數(shù)(mg／g)和胸腺指數(shù)(mg／g)：

1.3.3.3 小鼠脾淋巴細胞的制備

用頸椎脫臼法處死小鼠并將其放入75%乙醇中浸泡5min消毒，在無菌條件下，剪開皮膚和腹壁，剝離脾臟并稱重，在200目尼龍網(wǎng)上用塑料注射器芯研碎脾臟獲取單細胞懸液，用0.83%氯化銨(NH4Cl)破碎紅細胞，用Hank′s液洗3次，1 000r／min離心15min棄上清，加入完全培養(yǎng)基。用臺盼藍染色法檢測細胞活性，保證活細胞數(shù)大于95%，并調(diào)節(jié)細胞濃度為5×106個／mL。

1.3.3.4 淋巴細胞增殖活性的測定

MTT比色法測定淋巴細胞增殖活性[13]。在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔添加已制備的各實驗組的脾細胞懸液200μL，置于37℃5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。在培養(yǎng)結束前4h，每孔中加入 MTT(5mg／mL)10μL。繼續(xù)孵育4h。離心，棄上清，加入DMSO 150μL。用多孔酶標測定儀于570nm處測吸光值。

1.3.3.5 自然殺傷細胞(NK細胞)活性測定

無菌條件下取小鼠脾細胞，調(diào)整細胞數(shù)為5×106個／mL，作為效應細胞，取小鼠淋巴瘤細胞Yac－1(大連醫(yī)科大學病理室贈送)，調(diào)整細胞數(shù)為1×105個／mL，作為靶細胞。在96孔細胞培養(yǎng)板中，分別設效應細胞孔、效靶細胞孔和靶細胞孔3組，每孔加入相應細胞懸液，效靶細胞比例為50∶1，每孔總體積為200μL，不足部分以完全培養(yǎng)基補足。置于5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h。根據(jù)CCK－8測定生存細胞活性[14]。NK細胞殺傷活性按公式(3)計算。

1.3.3.6 抗體生成水平的測定

根據(jù)Gan等[15]方法檢測血清中SRBC抗體，0.2mL 2%SRBC在體內(nèi)實驗結束前5d對小鼠腹腔注射，經(jīng)5d免疫后，從小鼠眼眶取血，分離血清。依次加入2%GGVB緩沖溶液稀釋的SRBC 100μL、50倍稀釋的補體100μL、10倍稀釋的小鼠血清10μL，混勻后，37℃恒溫0.5h，置入冰浴終止反應，2 500r／min離心15min，取上清，于波長414nm測吸光值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS15.0對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One－way AVOVA)，數(shù)據(jù)用(平均值±標準偏差)(M±SD)表示。p＜0.05表示與對照組比較有顯著性差異(具有統(tǒng)計學意義)，p＜0.01表示差異極其顯著。

2 結果與討論

2.1 裙帶菜孢子葉多糖對小鼠不同組織的氧化損傷的影響

MDA是氧自由基損傷組織或細胞導致脂質(zhì)過氧化的最重要的產(chǎn)物之一。SOD能催化清除超氧陰離子自由基的反應，使生物體免受超氧陰離子自由基的損傷。GSH－Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，它特異的催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進過氧化氫的分解。MDA水平、SOD和GSH－Px的活性可以表征機體的氧化損傷。

本文考察了裙帶菜孢子葉多糖對氧化損傷小鼠體內(nèi) MDA水平、SOD和GSH－Px活力的影響。如表1所示，注射D－半乳糖后，模型組中小鼠血清和腦組織中的MDA水平極其顯著高于陰性對照組(p＜0.01)，SOD和GSH－Px活力顯著低于陰性對照組(p＜0.01，p＜0.05)，說明小鼠氧化損傷模型建成。此時小鼠機體抗氧化功能顯著降低，自由基清除能力減弱。與模型組相比，各劑量裙帶菜孢子葉多糖組小鼠的血清和腦組織中MDA水平極其顯著下降(p＜0.01)，并且高劑量組的MDA水平與空白對照組小鼠接近；各劑量裙帶菜孢子葉多糖組小鼠的血清和腦組織中的SOD活力和GSH－Px活力都極其顯著提高(p＜0.01)。以上結果表明，裙帶菜孢子葉多糖可以提高氧化損傷小鼠抗氧化酶活力，降低MDA含量，恢復機體抗氧化能力。

表1 裙帶菜孢子葉多糖對氧化損傷小鼠血液和腦組織中MDA水平、SOD和GSH－Px活力的影響Tab.1 Effects of PSU on MDA level，SOD and GSH－Px in tissues of oxidative－damaged mice

2008年 Wang等[16]和 Ye等[17]報道褐藻多糖具有清除自由基的能力。此報道為裙帶菜孢子葉多糖具有較好的體內(nèi)抗氧化活性提供了支撐。

2.2 裙帶菜孢子葉多糖對小鼠免疫器官的影響

免疫器官(脾臟和胸腺)的相對質(zhì)量是非特異性免疫功能的重要參數(shù)。如表2所示，與陰性對照組相比，各劑量的裙帶菜孢子葉多糖組中小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)極其顯著提高(p＜0.01)。并且高劑量裙帶菜孢子葉多糖組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯高于低劑量組。

2.3 裙帶菜孢子葉多糖對細胞免疫功能和抗體生成的影響

淋巴細胞增殖是一種廣泛使用的反映免疫應答能力的檢測方法。如表3所示，中、高劑量裙帶菜孢子葉多糖組小鼠的淋巴細胞增殖能力顯著提高(p＜0.05，p＜0.01)。

表2 裙帶菜孢子葉多糖對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響Tab.2 Effect of the PSU on spleen and thymus indices of mice

NK細胞被認為是非特異性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。各劑量裙帶菜孢子葉多糖組的NK細胞的活性極其顯著增強(p＜0.01)(表3)。這些結果與 Maruyama等[18－19]在裙帶菜孢子葉中提取的褐藻多糖硫酸酯提高NK細胞的細胞溶解活性的研究報告相一致。另外，中高劑量裙帶菜孢子葉多糖組中小鼠血清中的抗體生成水平極其顯著提高(p＜0.01)。以上結果表明，裙帶菜孢子葉多糖具有顯著的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性。

表3 裙帶菜孢子葉多糖對小鼠淋巴細胞增殖、NK細胞殺傷活性和抗體生成能力的影響Tab.3 Effects of PSU on the lymphocytes proliferation，NK cell phagocytosis activities and antibody production in serum of mice

3 結 論

(1)裙帶菜孢子葉多糖能夠顯著降低血清和腦組織中MDA水平，提高SOD活力和GSH－Px活力，說明裙帶菜孢子葉多糖具有良好的體內(nèi)抗氧化活性。

(2)裙帶菜孢子葉多糖顯著提高了小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)，促進淋巴細胞增殖，增強NK細胞的殺傷活性，并提高小鼠血清中的抗體生成水平，說明裙帶菜孢子葉多糖具有良好的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性。

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