子癇前期患者胎盤中m iRNA-1O1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達和意義

常玉華,李坤

(1.山東省交通醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟南 250031;2.山東省醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟南 250031)

子癇前期患者胎盤中m iRNA-1O1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達和意義

常玉華1,李坤2

(1.山東省交通醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟南 250031;2.山東省醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟南 250031)

目的 探討子癇前期患者胎盤中miRNA-101和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達和意義。方法 選取2013年5月～2014年5月入住山東省交通醫(yī)院分娩的100例產(chǎn)婦的胎盤絨毛組織，隨機均分為對照組和子癇前期組，每組各50例。采用RT-PCR法檢測各組胎盤組織中miRNA-101的表達情況；Western blot法檢測過表達和封閉miRNA-101后，各胎盤組織ERp44的表達情況；采用流式細胞儀檢測滋養(yǎng)細胞的凋亡情況。結果 與對照組相比，子癇前期組中miRNA-101的表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。在滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo中過表達miRNA-101后，ERp44的表達顯著下調(diào)（P＜0.05)；封閉miRNA-101后，ERp44的表達上調(diào)（P＜0.05)；過表達miRNA-101，細胞凋亡數(shù)量減少；封閉miRNA-101，細胞凋亡數(shù)量增加。結論 子癇前期中，miRNA-101可通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達來調(diào)控胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡過程。

miRNA-101；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44；滋養(yǎng)細胞；子癇前期

子癇前期(preeclapmpsia,PE),是一種十分常見的妊娠并發(fā)癥,其發(fā)病率約為3%～5%［1-2］,臨床表現(xiàn)以蛋白尿和高血壓為主,并伴有周身小血管痙攣和多臟器損傷,是造成圍生期母嬰死亡的主要原因之一［3-5］。目前,對于子癇前期的病因及發(fā)病機制并不十分清楚,臨床上通常采用解除血管痙攣和降血壓等對癥治療,但其預后并不理想。在以往的治療病例中發(fā)現(xiàn),子癇前期多發(fā)生在妊娠20周胎盤功能成熟后,而當患者娩出胎盤后,與子癇前期相關的各種癥狀得以迅速緩解［6-7］。表明子癇前期可能是一種胎盤相關性疾病。胎盤作為妊娠的天然屏障,在妊娠過程中起著十分重要的作用。胎盤主要功能細胞是滋養(yǎng)細胞,它是胚胎與母體直接接觸的部分,能夠產(chǎn)生細胞粘附分子,趨化因子等,從而保證妊娠的正常進行［8-9］。近年來研究表明,胎盤滋養(yǎng)層細胞發(fā)生凋亡與子癇前期的發(fā)病密切相關,而滋養(yǎng)層細胞凋亡主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的凋亡途徑有關［10-11］。正常情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可使機體免受損傷,但當應激過強時則會激活某些與細胞凋亡相關的信號通路,使細胞發(fā)生程序性死亡［12-13］。因此胎盤中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應激與子癇前期的發(fā)病密切相關。研究表明,子癇前期患者胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中ERp44蛋白、ERp60蛋白和蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶出現(xiàn)表達上調(diào)的現(xiàn)象,其中ERp44蛋白的表達高出正常孕婦的數(shù)倍,表明ERp44蛋白與子癇前期的發(fā)病密切相關［14-15］。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中的非編碼單鏈RNA分子,可通過抑制靶mRNA的翻譯,調(diào)控目的基因的表達,達到調(diào)控細胞分化、增殖和凋亡的目的。因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達很可能也受到miRNA的調(diào)控。本研究旨在通過檢測子癇前期孕婦和正常孕婦胎盤組織中miRNA和ERp44的表達情況,探討miRNA-101與ERp44在子癇前期滋養(yǎng)細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2013年5月～2014年5月入住山東省交通醫(yī)院分娩的100列產(chǎn)婦的胎盤絨毛組織,對照組和子癇前期組各50例,年齡24～29歲,平均(26±2)歲,2組年齡無統(tǒng)計學差異。所有標本均在受試者知情同意后收集,除患者簽署知情同意書外還得到醫(yī)院倫理委員會的批準。排除標準:①有先天性遺傳性疾病;②有子宮肌瘤等婦科疾病;③多胎;④有其他妊娠期并發(fā)癥;⑤有高血壓、心臟病,腎炎等原有基礎病。

1.2 材料

1.2.1 標本取材:所有標本均取自分娩后近臍帶部位的無鈣化和無壞死的絨毛組織。標本取材后用PBS淋洗3次,于離體20min之內(nèi)取新鮮組織60mg,立刻凍存于-72℃冰箱。在2h之內(nèi)提取所有標本的總RNA,然后立刻逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 細胞及試劑:HTR-8/SVneo人滋養(yǎng)細胞(中國科學院上海細胞研究所)。TrizolRNA試劑盒(美國Invitrogen公司),M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國NEB公司),5U/μLTaqDNA聚合酶(廣州東盛生物科技有限公司),ERp44單克隆抗體(DAKO公司,美國),羊抗兔二抗(北京中衫金橋公司,中國),miRNA-101 mimics、miRNA-NCinhibitor、anti-miRNA-NCinhibitor和 antimiRNA-101均購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 人滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo培養(yǎng)和處理:HTR-8/SVneo細胞用含10%胎牛血清、青霉素1×105IU/L、鏈霉素100mg/L的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞融合到85%左右時,用0.25%胰酶消化,以5×105的密度接種于6孔板,培養(yǎng)24h待細胞貼壁。

1.3.2 RT-PCR法檢測2組胎盤組織中miRNA-101的表達:采用 Trizol法提取離體胎盤組織細胞的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體實驗操作按照RT-PCR試劑盒的說明進行,反應體系為50μL,94℃下先預變性4min,然后按照94℃,30s;60℃,60s;72℃,120s,進行30個循環(huán),最后72℃下延伸10min。取RT-PCR的產(chǎn)物10uL進行電泳,相對分子質(zhì)量標準采用pucMix Marker,使用凝膠掃描系統(tǒng)掃描目的基因和β-actin基因的光密度值,目的基因光密度與β-actin基因光密度的比值反映該目的基因mRNA的表達水平。

1.3.3 Westernblot法檢測過表達和封閉miRNA-101對ERp44蛋白表達的影響:HTR-8/SVneo人滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)于6孔板。過表達 miRNA-101:細胞轉(zhuǎn)染 miRNA-101mimics增強劑(miRNA-NCinhibitor抑制劑為陰性對照);封閉miRNA-101:細胞轉(zhuǎn)染anti-miRNA-101抑制劑(anti-miRNA-NCinhibitor為陰性對照)48h后進行過表達和干擾效率檢測。收集細胞,然后提取各組細胞蛋白。取煮沸后的蛋白質(zhì)樣品用SDS-PAGE電泳分離,然后轉(zhuǎn)移至Millipore膜。用脫脂奶粉封閉1h后,用ERp44單克隆抗體4℃孵育過夜,緊接著用辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育,采用ECL放射自顯影法。最后將膠片掃描,分析目標帶的分子量和光密度值,β-actin作為內(nèi)參對照,2者光密度比值即為目的蛋白的相對表達水平。

1.3.4 流式細胞儀檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染的HTR-8/SVneo細胞凋亡:HTR-8/SVneo人滋養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)染48h后,用0.25%胰酶消化,4℃下離心5min,棄去上清,加10μLAnnexinVFITC熒光探針和5μL的碘化丙錠,避光室溫孵育20min。流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件,正態(tài)計量數(shù)據(jù)以“±s”表示,2組間的資料比較采用t檢驗,相關分析采用Pearson法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組胎盤組織中miRNA-101的表達比較 RT-PCR結果顯示:子癇前期組和正常對照組的產(chǎn)婦胎盤中miRNA-101的相對表達量分別為(0.41±0.02)和(0.82±0.03),2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,見圖1)。

圖1 RT-PCR檢測2組miRNA-101的表達Fig.1 TheexpressionofmiRNA-101intwogroupstestedbyRT-PCR

2.2 在HTR-8/SVneo細胞過表達和抑制miRNA-101后對ERp44蛋白表達的影響 Westernblot結果顯示:過表達miRNA-101組中ERp44的表達顯著下調(diào),是轉(zhuǎn)染miRNA-101NC組的數(shù)十倍;而轉(zhuǎn)染anti-miRNA-101組中的ERp44表達也高于轉(zhuǎn)染anti-miRNANC組(見圖2、表2)。說明子癇前期患者胎盤組中的miRNA-101基因表達與ERp44蛋白的表達呈負相關,miRNA-101可能通過調(diào)控ERp44的表達在子癇前期的發(fā)病中起著一定的作用。

圖2 過表達和抑制miRNA-101基因后對ERp44蛋白表達的影響Fig.2 EffectofoverexpressionorinhibitionofmiRNA-101onERp44expression

表2 各組ERp44蛋白表達比較Tab.2 Comparison of ERp44 expression in each group

2.3 miRNA-101對HTR-8/SVneo細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果顯示:在HTR-8/SVneo人滋養(yǎng)細胞中過表達miRNA-101,細胞凋亡顯著減少;封閉miRNA-101表達后,細胞凋亡數(shù)量顯著增加(見圖3)。

圖3 流式細胞儀檢測mi RNA-101對滋養(yǎng)細胞凋亡的作用A:miRNA-NC;B:miRNA-101 mimics;C:anti-miRNA NC;D:anti-miRNA-101Fig.3 Effect ofmiRNA-101 on apoptosis of trophoblast cells tested by flow cytometryA:miRNA-NC;B:miRNA-101 mimics;C:anti-miRNA NC;D:anti-miRNA-101

3 討論

微小RNA是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在的非編碼單鏈RNA分子,由19～25個核苷酸構成［16］。miRNA能夠通過對靶mRNA的抑制和降解作用,對目的基因的轉(zhuǎn)錄翻譯進行調(diào)控,從而進一步調(diào)控細胞分化、增殖和凋亡［17］。研究表明,miRNA可以參與機體許多重要的生理病理過程。近年來,其對子癇前期中滋養(yǎng)細胞凋亡的調(diào)控作用成為研究的熱點［18］。有文獻報道,子癇前期的發(fā)生涉及到很多miRNAs的異常表達,在許多重度子癇前期患者中,miRNA都出現(xiàn)表達下調(diào)的現(xiàn)象。本研究通過對50例子癇前期和50例正常妊娠的孕婦胎盤組織中miRNA-101的水平檢測,發(fā)現(xiàn)子癇前期患者miRNA-101的表達顯著性低于正常對照組,表明miRNA-101可能參與了子癇前期的發(fā)病過程。

子癇前期往往伴隨著滋養(yǎng)細胞的凋亡,而滋養(yǎng)細胞是母體與胚胎直接接觸的部分,是胎盤的主要功能細胞。本研究結果顯示,過表達miRNA-101會使得滋養(yǎng)細胞凋亡數(shù)目顯著減少,而封閉miRNA-101的表達則可促使滋養(yǎng)細胞凋亡。研究說明,胎盤滋養(yǎng)層細胞發(fā)生凋亡與子癇前期的發(fā)病密切相關,而滋養(yǎng)層細胞凋亡主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的凋亡途徑有關。一般正常情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可使機體免受損傷,但當應激過強時則會激活某些與細胞凋亡相關的信號通路,使得細胞發(fā)生程序性死亡。本研究還顯示miRNA-101的表達與ERp44的表達呈負相關,說明miRNA-101可能通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達參與子癇前期的發(fā)病。

綜上所述,在子癇前期中,miRNA-101表達下調(diào)可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白ERp44的表達增加。下一步將對與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白ERp44的表達增加相關的信號通路進行研究,探討促使胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡的具體機制。

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(編校:吳茜)

m iRNA-1O1 regulates apoptosis of trophoblast cells in preeclampsia by targeting endoplasm ic reticulum protein 44

CHANG Yu-hua1,LIKun2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Traffic Hospital of Shandong Province,Ji'nan 250031,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital of Shandong Province Academy of Medical Sciences,Ji'nan 250031,China)

Objective To explore the possiblemechanism ofmiRNA-101 regulates endoplasmic reticulum protein ERp44 and apoptosis of placental trophoblast in preeclampsia.Methods 100 cases experimental object from May 2013 to May 2014 in our hospital was selected and divided into two groups.ThemiRNA-101 expression in two groups were detected by RT-PCR.ERp44 expression were detected by western blot when overexpressed and inhibited miRNA-101.At the same time,the number of cell apoptosis was tested by Flow cytometry.Results Compared with control group,the expression ofmiRNA-101 in PE group were decreases(P＜0.05).The level of ERp44 was elevated and the number of cell apoptosis reduced after miRNA-101 overexpression;the level of ERp44 was declined and the number of cellapoptosis increased after inhibite the expression ofmiRNA-101(P＜0.05).Conclusion mi RNA-101 regulates apoptosis of trophoblast cells by regulating the expression of ERp44 in patientswith preeclampsia.

miRNA-101;endoplasmic reticulum protein 44;trophoblast cells;preeclampsia

R714.245

A

1005-1678（2014)06-0038-04

山東省自然科學基金(ZR2009CL027)；山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學基金(201023)

常玉華，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科學，E-mial：qch1821460008@163.com。