不同生境中密蒙花黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異1)

陳蘭英 權(quán)秋梅 秦 芳 黎云祥

(西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西華師范大學(xué))，南充，637000)

密蒙花(Buddleja officinalis Maxim)為馬錢科(Loganiaceae)醉魚草屬(Buddleja)半陰生灌木植物的干燥花及花序，為傳統(tǒng)中藥，具有清熱養(yǎng)肝、明目退翳之功效[1－2]。現(xiàn)代化學(xué)成分與藥理活性研究表明，總黃酮、苯乙醇苷類、三萜類是密蒙花中重要的次生代謝產(chǎn)物，蒙花苷為黃酮類化合物的主要成分[3－7]。許多研究表明密蒙花中木犀草素及芹菜素類化合物雖然質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，但其質(zhì)量分?jǐn)?shù)與蒙花苷成一定的組成關(guān)系，且木犀草素和芹菜素具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎等作用[8－12];黃色素也是密蒙花黃酮類化合物的活性成分，作為添加劑用于食品著色，筆者提取黃色素的主要成分蒙花苷做藥理及傳粉方面的研究[13]。目前對(duì)密蒙花的干燥花及花序的黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其藥理作用方面，有專家進(jìn)行了廣泛的研究，并證明它們具有較高的藥用價(jià)值[14－16];而對(duì)生態(tài)學(xué)方面的研究相對(duì)較少，特別是生境異質(zhì)性對(duì)密蒙花不同部位次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響還未見相關(guān)的報(bào)道。筆者選擇3種不同的生境，對(duì)密蒙花不同部位的蒙花苷、木犀草素和芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其環(huán)境因子進(jìn)行了分析，探討生境異質(zhì)性和環(huán)境因子對(duì)密蒙花主要黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，為科學(xué)合理利用野生密蒙花資源、規(guī)范化栽培及提高產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)地概況

研究地位于四川盆地中部南充市與廣安市交界地金城山森林公園，北緯 30°45'，東經(jīng) 106°28'，地處北亞熱帶，屬于亞熱帶暖氣候區(qū)，季風(fēng)氣候明顯，四季分明，熱量豐富，年均氣溫17.5℃，年均降水量在1100 mm 左右[17]。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用美國(guó)Agilen公司1100型高相液相色譜儀(含脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器)，美國(guó)Thermo NanoDrop ND－200C微量紫外分光光度計(jì)，德國(guó)Sartorius公司BP211D型電子天平，德國(guó)Eppendorf Research移液器，Millipope公司MillQ型純水儀，上海亞榮SHZ－Ⅲ循環(huán)水真空泵，Autoscience過濾器。對(duì)照品蒙花苷(批號(hào)MUST－12081203，純度≥98%，HPLC)、木犀草素(批號(hào) MUST－12100401，純度≥98%，HPLC(高效液相色譜法))、芹菜素(批號(hào)MUST－12050505，純度≥98%，HPLC)購(gòu)于成都松青生物科技有限公司，甲醇為色譜純(Merck公司)，水為高純水，其余試劑為分析純。樣地環(huán)境因子的測(cè)定采用法國(guó)KIMO溫度濕度計(jì)、美國(guó)3413F－Field Scout光照計(jì)等進(jìn)行。

2.2 樣地設(shè)置及取樣

在2012年4月密蒙花的繁殖期，選取林內(nèi)、林隙和林緣3種不同海拔生境的密蒙花種群設(shè)置樣方及取樣。實(shí)驗(yàn)中利用溫度濕度計(jì)、光照計(jì)測(cè)定各個(gè)種群中的溫度、濕度和相對(duì)光照(林下光照強(qiáng)度與裸地光照強(qiáng)度之比)，為避免環(huán)境因子測(cè)定誤差，3個(gè)種群同時(shí)測(cè)定并重復(fù)測(cè)5次。每種生境選擇5～10株成齡密蒙花個(gè)體，對(duì)各個(gè)部位分別采樣，其中花是按照不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段即花蕾期和盛花期分別采樣。將野外采集的密蒙花樣品于室內(nèi)陰涼通風(fēng)處干燥，制成粉末過40目篩后備用。

2.3 不同生境環(huán)境因子差異分析

3種生境的環(huán)境因子存在一定的差異(見表1)。3個(gè)樣地中相對(duì)光照度差異極顯著(P＜0.01)，溫度和相對(duì)濕度3生境無顯著差異。其中，林內(nèi)(生境Ⅰ)相對(duì)濕度最高，相對(duì)光照度較低;林緣(生境Ⅲ)則相反;林隙(生境Ⅱ)各項(xiàng)生境特征均處于3種生境的中間水平。

表1 密蒙花不同生境主要環(huán)境因子概況

2.4 蒙花苷、木犀草素和芹菜素的提取與測(cè)定

參照許龍等[18－19]的方法對(duì)密蒙花中3種黃酮類化合物進(jìn)行提取和測(cè)定，略做修改，確定最好的流動(dòng)相比例。在240～370 μm內(nèi)測(cè)定吸收值，分別選擇對(duì)照品蒙花苷、木犀草素和芹菜素均有的相對(duì)較大吸收波長(zhǎng)為樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)。具體提取和測(cè)定方法:用甲醇分析純?yōu)樘崛?，分別稱取0.5 g密蒙花各部位供試樣品各3份，加95%甲醇25 mL，70℃水浴回流浸提2次，每次1 h，趁熱過濾并用甲醇提取殘?jiān)喜⑾礈煲?，冷卻后用甲醇定容到50 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，得到供試樣品。色譜條件:色譜柱為 Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為 V(甲醇) ∶V(0.2%磷酸水)=56 ∶44;流速為0.8 μL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm;注溫30℃。

2.5 方法學(xué)考查

2.5.1 線性關(guān)系的測(cè)定

蒙花苷、木犀草素和芹菜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:精密稱取蒙花苷標(biāo)準(zhǔn)品4.1 mg、木犀草素3.2 mg、芹菜素4 mg;分別置50 mL容量瓶中，依次加50 mL甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為0.082、0.064、0.08 g·L－1的對(duì)照品溶液。分別取 3 種對(duì)照品溶液，并分別進(jìn)樣 2、4、6、8、10 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值y對(duì)對(duì)照品的進(jìn)樣量x進(jìn)行線性回歸。

2.5.2 重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗(yàn)

重復(fù)性:取密蒙花樣品，按照蒙花苷、木犀草素和芹菜素的提取制備方法同時(shí)配制6份，進(jìn)樣10 μL，測(cè)得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。精密度:分別精密量取蒙花苷、木犀草素和芹菜素對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，求各對(duì)照組分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。穩(wěn)定性:取供試樣品溶液存放于冰箱中(4℃)24 h，分別在 0、6、12、18、24 h 測(cè)定，記錄峰面積，求各組分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。加樣回收率:精密吸取供試樣品18份，分別置20 mL容量瓶中，分成3組，分組加入一定量的蒙花苷、木犀草素、芹菜素對(duì)照品，通過外標(biāo)法分別計(jì)算加標(biāo)后蒙花苷、木犀草素和芹菜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，最后計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析及多重比較法，檢驗(yàn)不同部位黃酮類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異，并用相關(guān)分析法對(duì)生境環(huán)境因子與次生代謝產(chǎn)物間的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃酮類化合物色譜分離

在上述色譜條件下，對(duì)照品的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的保留時(shí)間為:蒙花苷4.774 min、木犀草素 5.741 min、芹菜素 8.167 min(見圖 1a—圖 1c)。圖1d(花蕾)為樣品的保留時(shí)間，所有測(cè)定樣品中蒙花苷的保留時(shí)間為(4.726±0.114)min，木犀草素的保留時(shí)間為(5.587±0.252)min，芹菜素的保留時(shí)間為(8.254±0.168)min，與對(duì)照品的保留時(shí)間誤差小于0.5 min，整個(gè)分離過程需 10 min。

3.2 黃酮類化合物線性關(guān)系

3種黃酮類成分的線性方程分別為:芹菜素，R2=1;木犀草素，R2=0.9997;蒙花苷，R2=0.9997。根據(jù)線性方程可以計(jì)算出蒙花苷在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.164～0.82 μg·g－1、木犀草素在 0.128～0.64 μg·g－1、芹菜素在 0.16～0.8 μg·g－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于定量分析。

3.3 重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性、回收率試驗(yàn)結(jié)果

蒙花苷、木犀草素和芹菜素的重復(fù)性(n=6)、精密度(n=6)、穩(wěn)定性(n=6)和加樣回收率(n=6)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見表2):樣品的重現(xiàn)性良好、儀器進(jìn)樣精密度良好、樣品溶液均在24 h內(nèi)穩(wěn)定及該實(shí)驗(yàn)的提取和測(cè)定方法是穩(wěn)定、可信的。

圖1 對(duì)照品及樣品HPLC圖

表2 HPLC回收率、重復(fù)性、精密度及穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果 %

3.4 蒙花苷、木犀草素和芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性

由表3可以看出，3個(gè)生境中的蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均與木犀草素呈極顯著正相關(guān)，與芹菜素呈顯著正相關(guān)。而木犀草素與芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)除生境Ⅲ外，兩者間呈顯著正相關(guān)。因此，蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，木犀草素與芹菜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也會(huì)相應(yīng)地高些。

表3 3種黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)

3.5 不同生境及不同部位蒙花苷、木犀草素和芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)比

方差分析及多重比較分析表明，在不同生境條件下及不同開花時(shí)期，盛開花的蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于花蕾(P＜0.01)，莖、葉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著(P＜0.05)，不同部位中蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)從大到小順序?yàn)榛?、葉、莖。由表4可知，生境Ⅱ盛開花、花蕾、莖的蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3個(gè)生境中最高，生境Ⅰ蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均最低。莖中生境Ⅰ的蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)和生境Ⅲ無顯著差異;葉中生境Ⅰ的蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，生境Ⅱ和生境Ⅲ的蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著差異。

在不同生境條件下，盛開花、花蕾和莖的木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)生境Ⅱ與生境Ⅰ、生境Ⅲ的差異顯著(P＜0.05)，而生境Ⅰ與生境Ⅲ均無顯著差異(P＞0.05)，不同開花時(shí)期，盛開花的蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于花蕾(P＜0.05)。可知，生境Ⅱ盛開花的木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在所有的生境和部位中達(dá)到最高值，其次是生境Ⅱ花蕾中的質(zhì)量分?jǐn)?shù);葉中生境Ⅰ的木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，與生境Ⅲ相比有差異但沒有達(dá)到顯著水平，而與生境Ⅱ相比有顯著差異(P＜0.05)，生境Ⅱ和生境Ⅲ相比木犀草質(zhì)量分?jǐn)?shù)有差異，但沒有達(dá)到顯著水平。

在不同生境條件下，花蕾、盛開花和葉的芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異極其顯著(P＜0.01)，不同部位中芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異極其顯著(P＜0.05)，從高到低順序?yàn)榛?、葉、莖;不同開花時(shí)期，盛開花的蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于花蕾(P＜0.05)。可知，莖中芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)生境Ⅰ最高，與生境Ⅱ生境Ⅲ有顯著差異(P＜0.05)，而生境Ⅱ和生境Ⅲ無差異。其中，生境Ⅱ的各個(gè)部位的質(zhì)量分?jǐn)?shù)除莖外在3個(gè)生境達(dá)到最高值，其中，盛開花的芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是生境Ⅱ花蕾中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3.6 密蒙花3種黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

由表5可以看出，花蕾、盛開花中的芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與海拔因子呈極顯著正相關(guān)，而花蕾、盛開花中蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其呈顯著正相關(guān);花蕾、盛開花中的蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均與相對(duì)光照呈極顯著正相關(guān)，花蕾、盛開花中木犀草素和芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與光照呈顯著正相關(guān)，葉中3種黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均與相對(duì)光照呈顯著正相關(guān)。莖中的蒙花苷和芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與相對(duì)光照呈極顯著負(fù)相關(guān)，木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與相對(duì)光照呈顯著負(fù)相關(guān)。

表5 3種黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)

3種黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)與溫度和相對(duì)濕度相關(guān)性不顯著。相關(guān)性結(jié)果表明，光照是影響密蒙花黃酮類化合物的主要限制因子，且隨著光照的增加而增加。但是，光照對(duì)不同藥用植物次生代謝的作用并不一致;研究藥用植物的影響因子時(shí)，要綜合考慮植物本身特定生理生化特征[20]。對(duì)于陽生植物，光照的增加能夠提高其次生代謝物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù);陰生植物適當(dāng)減少光照度可使次生代謝物增加;而對(duì)于中間型的半陰生植物，中等適中的光照條件才有利其維持生理代謝[20－21]。因此，光照度適中的生境Ⅱ的黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于低光照生境Ⅰ的和高光照生境Ⅲ的。

4 結(jié)論與討論

研究環(huán)境因子對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)物及藥效成分的影響機(jī)制具有重要的意義，可為藥用植物栽培環(huán)境的選擇以及相適應(yīng)的栽培技術(shù)制定提供理論依據(jù)[22－23]。環(huán)境因子(海拔、溫度、水分、光照)對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累起著重要的誘導(dǎo)作用甚至脅迫[24]。如:在非最佳溫度下玉米向光面積累花青素防止光抑制造成傷害[25]，黃豆在低溫下培養(yǎng)24h根部代謝水平顯著增高[26]，遮陰導(dǎo)致高山紅景天苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低[27]，重度的水分脅迫有利于金錢草總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的積累[28]。本研究中密蒙花3種黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均表現(xiàn)出中等水平強(qiáng)光區(qū)生境Ⅱ要顯著高于弱光區(qū)生境Ⅰ和較高強(qiáng)光區(qū)生境Ⅲ，而生境Ⅰ最低。同時(shí)，在相關(guān)性分析中，密蒙花的花蕾、盛開花中的蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均與相對(duì)光照度呈極顯著正相關(guān)，花蕾、盛開花中木犀草素和芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其呈顯著正相關(guān)，葉中3種黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均與相對(duì)光照度呈顯著正相關(guān)。這說明光照是密蒙花黃酮類成分積累的最重要限制因素。同時(shí)，根據(jù)植物對(duì)光照強(qiáng)度要求的不同，可分為陽生植物、陰生植物及中間類型。陽生藥用植物金銀花中陽坡綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于陰坡[29]，絞股藍(lán)在強(qiáng)光條件下黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高[30];陰生藥用植物如人參皂苷適當(dāng)遮陰能增加其黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)[31]。綜合考慮相關(guān)性分析結(jié)果及密蒙花本身的生理生化特征認(rèn)為，密蒙花屬于半陰生植物[1，13]，低光照和高光照都不利于該植物的生長(zhǎng)從而會(huì)影響次生代謝產(chǎn)物的生成。

由于植物不同生長(zhǎng)時(shí)期器官的生理機(jī)能不同，次生代謝產(chǎn)物可在原處聚集或轉(zhuǎn)化，這使其在植物器官中的分布情況有較大的差異[32]。本研究中，不同生境的密蒙花3種黃酮類成分均是蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)次之，木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。不同部位的比較中，3種黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在盛開花中最高，其次是花蕾，莖和葉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較低，其中莖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。花色素苷代謝屬于類黃酮化合物代謝的分支途徑，是決定花色的主要色素，除吸引昆蟲幫助授粉外還具有防紫外線灼傷等作用[33－35]。楊勝遠(yuǎn)等人對(duì)密蒙花花序進(jìn)行黃色素色階分析，結(jié)果表明黃色素主要存在于花[36－37]。密蒙花以有性繁殖為主[38－39]，在密蒙花繁殖期，花為蒙花苷的主要聚集地，吸引昆蟲傳粉。因此，花中的黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)要顯著高于其他部位，盛開花要高于花蕾。

在金城山的不同生境中，生境Ⅱ3種黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，表明中等水平光照條件有利于密蒙花次生代謝產(chǎn)物的合成。在引種栽培密蒙花時(shí)，應(yīng)模擬野外生長(zhǎng)條件，提供適宜的光照條件避免弱光和較高光照。密蒙花不同部位的蒙花苷、木犀草素和芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均表現(xiàn)為盛開花要顯著高于花蕾、莖和葉。因此，應(yīng)在密蒙花的盛花期對(duì)要開放的花朵進(jìn)行及時(shí)采收，有利于提高藥材的質(zhì)量。

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