補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)A549/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)周期作用的影響

井歡，唐瑩，于丹，劉春英 Δ

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理教研室,遼寧 沈陽(yáng) 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖教研室,遼寧 沈陽(yáng) 110032）

補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)A549/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)周期作用的影響

井歡1，唐瑩2，于丹1，劉春英1Δ

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理教研室,遼寧 沈陽(yáng) 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖教研室,遼寧 沈陽(yáng) 110032）

目的評(píng)估補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)A549/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響效果。方法體外培養(yǎng)人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組，補(bǔ)中益氣湯組和脾細(xì)胞處理組。用不同濃度的補(bǔ)中益氣湯含藥血清和脾細(xì)胞刺激A549/DDP細(xì)胞，采用MTT法（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）測(cè)定2種方法對(duì)細(xì)胞的直接殺傷作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2種方法對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；熒光顯微鏡觀察2種方法對(duì)凋亡小體產(chǎn)生的影響。結(jié)果MTT法顯示同空白對(duì)照組相比，補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用(P＜0．05)，且該法同脾細(xì)胞作用后效果類(lèi)似；2種方法處理后，流式細(xì)胞術(shù)均可見(jiàn)特征性的細(xì)胞凋亡峰；在熒光顯微鏡下可見(jiàn)凋亡細(xì)胞。結(jié)論補(bǔ)中益氣湯含藥血清在體外能阻滯A 549/DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生凋亡，且效果同脾細(xì)胞類(lèi)似。

補(bǔ)中益氣湯；A 549/DDP細(xì)胞；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備 低溫超速離心機(jī)(OTD55B，DUPONT/SORVALL，美國(guó))；流式細(xì)胞儀（FACScan， BECTON DICKINSON，美國(guó)）；Milli-Qsp REAGENT Water System（美國(guó)）；倒置顯微鏡（JMS，NIKON，日本）；流式細(xì)胞儀（FACScan，BECTON DICKINSON，美國(guó)）。

2 方法

2.1 A549/DDP細(xì)胞的體外培養(yǎng)與傳代 每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。肉眼觀察培養(yǎng)液顏色，若由紅色轉(zhuǎn)為黃色，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，需要傳代：棄去培養(yǎng)基，加0.25%Trypsin 500 uL，37℃消化3 min后，加5 mL培養(yǎng)基輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞使其均勻脫落，制成單細(xì)胞懸液。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞懸浮、碎裂或其他污染情況則及時(shí)丟棄。

2.2 含藥血清的制備 將6只SD大鼠隨機(jī)分為補(bǔ)中益氣湯組和空白對(duì)照組，補(bǔ)中益氣湯組大鼠給與補(bǔ)中益氣湯11.34 g/kg體重，1日2次，空白對(duì)照組大鼠給與生理鹽水11.34 g/kg體重，1日2次。連續(xù)給藥處理后3 d，禁食12 h后，再次給藥后麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清后濾膜除菌，分裝，置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 脾細(xì)胞的制備 將1只SPF級(jí)BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，取脾組織用PBS洗凈，浸泡在含PBS的平皿中，用眼科剪盡可能剪碎組織，吸去上清液，組織塊轉(zhuǎn)移入大瓶中加入15 mL消化酶，37℃，30 min，并在磁力攪拌器上攪拌。在不銹鋼網(wǎng)上輕輕研磨，濾液用300目沙網(wǎng)過(guò)濾3次，置于DMEM培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1h后進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 MTT法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞直接殺傷作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0.25% Trypsin消化成單細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，96孔板分為 3個(gè)濃度組，（1×103/mL、1×104/mL、1×105/mL），每組3個(gè)平行孔，每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，置5% CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞貼壁24 h。最終確定實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞濃度為1×103/mL。將含藥血清用孔徑0.22 μm的一次性濾器除菌后，每孔中加10 μL溶液，終濃度為25 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL 及 200 μg/mL 4個(gè)梯度，設(shè) 3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照孔中加等量空白血清。置于5% CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育24 h。加入10 μLMTT溶液，充分混勻后置于5% CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育4 h。加入100 μL異丙醇鹽酸溶液，充分混勻后檢測(cè)OD450值。取脾細(xì)胞懸液，加DMEM培養(yǎng)基及10%胎牛血清，稀釋成1×103，再將其接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。培養(yǎng)72 h后加入細(xì)胞濃度為1×102的A549/DDP肺腺癌細(xì)胞，置含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，每孔加10 μL MTT溶液，充分混勻后置于37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)4 h。加人100 μL異丙醇鹽酸溶液，充分混勻后檢測(cè)OD450值。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取生長(zhǎng)良好的A549/DDP細(xì)胞以1×103/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，對(duì)照組加入10%空白血清，稀釋成1×103/mL，每孔100 μL，補(bǔ)中益氣湯組加入同濃度同體積的補(bǔ)中益氣湯含藥血清；置37℃，5%CO2溫箱培養(yǎng)24 h，用0.25%胰酶消化后，將細(xì)胞懸液加入離心管中，離心1000 r/min，5 min，去上清。取健康小鼠脾制成的脾細(xì)胞懸液，加DMEM培養(yǎng)基及10%胎牛血清，稀釋成1×103/mL，接種至6孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。用PBS清洗2次，1000 r/min離心5 min，去上清。將70%乙醇緩慢滴入試管中，邊滴邊搖動(dòng)試管，使細(xì)胞分散、固定，置4℃過(guò)夜備檢。上述固定的A549/DDP細(xì)胞離心去上清，用PBS清洗2次，1000 r/min離心5min，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×103/mL。取200 μL單細(xì)胞樣品，加200 μL RNase溶液(10 μg/mL)，置37℃水浴搖床30 min。將細(xì)胞過(guò)濾去除聚積成團(tuán)細(xì)胞，加250 μg/mL的碘化吡啶(PI)染液100 μL，置4℃，30 min，用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果采集用ModFit 3.0軟件分析。

2.6 熒光顯微鏡觀察凋亡小體 空白對(duì)照組加DMEM培養(yǎng)基及10%空白血清，稀釋成1×103/mL，接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。補(bǔ)中益氣湯組加DMEM培養(yǎng)基及10%補(bǔ)中益氣湯含藥清，稀釋成1×103/mL，接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。脾細(xì)胞處理組用脾細(xì)胞懸液，加DMEM培養(yǎng)基及10%胎牛血清，稀釋成1×103/mL，接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。取生長(zhǎng)良好的A549/DDP細(xì)胞以1×103/mL，37℃共同培養(yǎng)48 h，離心棄上清液，細(xì)胞4℃固定5 min，用PBS沖洗3遍，加人20 μL PBS和4μL濃度為1 mmol/L的熒光色素Hoechst 33258，混勻后4℃染色10 min。蒸餾水洗片后，用濾紙吸去多余液體。封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用EXCEL進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)計(jì)量資料以“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，定義α=0.05，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MTT法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞的殺傷作用 倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞增生旺盛，補(bǔ)中益氣湯組及脾細(xì)胞處理組細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，培養(yǎng)液中出現(xiàn)部分懸浮細(xì)胞(見(jiàn)圖1)。與空白對(duì)照組比較補(bǔ)中益氣湯組和脾細(xì)胞處理組均有顯著性抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用（P＜0.05）。2種方法抑制作用無(wú)顯著性差異（見(jiàn)表 1）。

圖1 不同處理方法對(duì)A549/DDP細(xì)胞的殺傷作用Fig.1 Killing Effect of A549/DDP cell by different treatment methods

表1 補(bǔ)中益氣湯及脾細(xì)胞對(duì)A549/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響Tab.1 The inhibition effect of A549/DDP cell by Buzhong Yiqi Decoction and spleen cells treatment respectively

3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 與空白對(duì)照組比較，補(bǔ)中益氣湯組和脾細(xì)胞處理組的樣品中均可見(jiàn)特征性的細(xì)胞凋亡峰，空白對(duì)照組中未見(jiàn)凋亡峰（見(jiàn)圖2）。

3.3 熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡作用 與空白對(duì)照組比較補(bǔ)中益氣湯組及脾細(xì)胞處理組熒光顯微鏡下均可見(jiàn)致密濃染的顆粒狀或塊狀熒光的凋亡細(xì)胞，空白對(duì)照組中未見(jiàn)（見(jiàn)圖3）。

圖2 不同方法對(duì)A 549/DDP肺癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Apoptosis of A 549 lung cancer cells by different methods treatment

圖3 不同方法對(duì)A549肺癌細(xì)胞凋亡小體的影響Fig.3 Effect of different methods on apoptotic bodies of A549 lung cancer cells by fluorescence microscopy

4 結(jié)論

隨著細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到細(xì)胞周期的紊亂不僅會(huì)產(chǎn)生多種疾病，而且與腫瘤等疾病的發(fā)生均有密切關(guān)系[4-5]。80年代以來(lái)，西方科學(xué)家對(duì)中藥研究產(chǎn)生了濃厚的興趣；至今已相繼報(bào)道了100多種具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗感染、等多種生理活性的中藥[6-8]；有的已在臨床用于腫瘤、肝炎、心血管等疾病的輔助治療和康復(fù)，其中最重要的藥理作用當(dāng)推免疫促進(jìn)作用。已有的大量藥理和臨床應(yīng)用表明，這些功能確切的物質(zhì)，其原生藥大多屬于補(bǔ)益類(lèi)中藥[9-10]。補(bǔ)中益氣湯作為補(bǔ)益劑的代表經(jīng)典方之一，健脾益氣，扶正祛邪，具有良好的臨床實(shí)際效果，從而引起人們廣泛的重視。由于化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制不明，導(dǎo)致目前應(yīng)用的中藥制劑多為粗制劑，在分子水平上闡明藥理作用的努力受到限制，因此加強(qiáng)這方面的研究非常必要[11-13]。研究證明：脾細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用并能誘導(dǎo)凋亡[14-15]。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新使用毒副作用小的補(bǔ)中益氣湯為研究對(duì)象，從細(xì)胞周期角度進(jìn)行研究，將結(jié)果同正常小鼠脾細(xì)胞作用后結(jié)果進(jìn)行比較分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的A549/DDP人肺腺癌腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，該效果同脾細(xì)胞處理后效果類(lèi)似。MTT顯示出其具有抗腫瘤作用，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示：補(bǔ)中益氣湯含藥血清可使腫瘤細(xì)胞增殖下降，細(xì)胞凋亡率增加，提示該方可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。免疫熒光亦提示：補(bǔ)中益氣湯含藥血清與脾細(xì)胞脾細(xì)胞均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征。綜上所述，補(bǔ)中益氣湯含藥血清在體外能阻滯A549/DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生凋亡，且效果同脾細(xì)胞類(lèi)似，具體機(jī)制及相關(guān)信號(hào)傳遞過(guò)程需在今后的研究中深入探討。

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Effect of Buzhong Yiqi Decoction serum on cell cycle of A 549/DDP cell

JING Huan1,TANG Ying2,YU Dan1, LIU Chun-ying1Δ

(1.Department of Pathology, College of Basic Medicine，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032,China;2.Department of Human Anatomy, College of Basic Medicine，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032 ,China)

ObjectiveTo study the effect of Buzhong Yiqi Decoction serum on cell cycle of A549/DDP cell.MethodsA549/DDP cells and splenocytes cells were cultured in vitro and divided randomly into three groups: control group, Buzhong Yiqi Decoction group and splenocyte group.A 549/DDP cells were stimulated by different concentrations of Buzhong Yiqi Decoction serum and spleen cells, the direct killing effect on cells were measured by MTT method, cell apoptosis were detected by flow cytometric analysis and the apoptotic body were observed by immunofluorescence method.ResultsMTT results showed that cell growth were inhibited by Buzhong Yiqi Decoction serum in contrast with control groups, and the effect was same as spleen cells, and both treated groups had similar effects. Marked apoptotic peak and the apoptotic body were seen by flow cytometric analysis and fluorescence microscope in both two groups.ConclusionBuzhong Yiqi Decoction could inhibit the proliferation of A549/DDP cells in vitro and induced cell apoptosis, which is the similar as spleen cells.

Buzhong Yiqi Decoction;A549/DDP cell;cell cycle;apoptosis

R 734．2

A

1005-1678(2014)02-0048-03

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全世界肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[1]，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。應(yīng)用化學(xué)藥物治療雖是臨床主要方法，但隨之而來(lái)的不良反應(yīng)（如頭暈、嘔吐、厭食、無(wú)力等），常導(dǎo)致化療失敗[2]。補(bǔ)中益氣湯出自金代名醫(yī)李東垣《脾胃論》，為經(jīng)典復(fù)方。由于肺癌細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的調(diào)控不敏感，導(dǎo)致生存期延長(zhǎng)，凋亡速度低于增殖速度[3]，從而導(dǎo)致疾病向惡性情況發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)主要觀察補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖及凋亡影響，并采用脾細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照因素，旨在研究該復(fù)方抗腫瘤的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 主要材料 A549/DDP細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究中心；胎牛血清、胰蛋白酶消化液、DMEM培養(yǎng)基及多聚賴(lài)氨酸均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；補(bǔ)中益氣湯藥材購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院；SD大鼠(體重180～200 g)、SPF級(jí)BALB/c小鼠(體重10～12 g)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：scxk(京)2011-0011。

遼寧省自然基金資助項(xiàng)目（20102145）

井歡，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥免疫調(diào)節(jié)與中藥抗腫瘤，E-mail：2974907780@qq.com;劉春英，通信作者，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥抗腫瘤作用機(jī)制研究，E-mail：chunying 99@163.com。